Thạc Sĩ đóng gói tế bào tiết insulin trong vỏ alginate

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cấy ghép tế bào có khả năng tiết insulin (Insulin secreting cells-ISC hay còn được gọi là Insulin producing cells-IPC) được đánh giá phương pháp cải tiến cho phương pháp cấy ghép các tiểu đảo (islet). Bằng việc sử dụng các tế bào tiết insulin được thu nhận in vitro, phương pháp này hầu như không có giới hạn về mặt số lượng, hoàn thiện hơn về chất lượng và hiệu quả cho điều trị thực nghiệm. Chính vì các ưu điểm vượt trội này mà phương pháp cấy ghép tế bào tiết ínuslin ngày càng được chú ý phát triển và cải tiến nhằm nâng cao hiệu quả trong điều trị.
Chuyển tế bào β có thể là một liệu phát hiệu quả trong việc điều trị bệnh tiểu đường. Phương pháp này cho thấy nồng độ glucose máu được điều hòa ổn định hơn so với phương pháp tiêm insulin. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp ghép tế bào là thời gian tồn tại của tế bào ghép trong cơ thể rất ngắn tùy thuộc vào hoạt động của hệ thống miễn dịch của cơ thể người nhận dẫn đến tế bào ghép nhanh chóng bị thải loại. Các nghiên cứu cho thấy hệ thống miễn dịch ở người và động vật, hệ thống miễn dịch nhanh chóng nhận diện và cô lập các tế bào ngoại lai dẫn đến các tế bào ghép mất dần chức năng và thoái hóa [2].
Phương pháp đóng gói các tế bào khắc phục được hiện tượng bị nhận diện và thải loại bởi hệ thống miễn dịch. Các tế bào ghép được bọc trong các vật liệu mang (ví dụ Poly-L-Lysine, Sodium algenate, DTDTTPA gadolinium-Dithiolated diethylenetriaminepentaacetic acid gadolinium ) vẫn đảm bảo khả năng tiết, hấp thu chất dinh dưỡng thông qua vỏ bọc nhưng không bị tác động bởi hệ thống miễn dịch [32].
Tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell-MSC) được đánh giá là có tiềm năng biệt hóa thành tất cả các tế bào hình thành từ ba lá phôi, bao gồm từ trung phôi bì, ngoại phôi bì thần kinh và nội phôi bì. Ngoài ra, TBG trung mô còn thể hiện những ưu điểm về sự biểu hiện kiểu hình miễn dịch [70]. TBG trung mô người và TBG trung mô chuột đã được chứng minh rằng có thể biệt hóa thành các tế bào có khả năng tiết insulin. Các tế bào tiết insulin khi được cấy ghép lên mô hình chuột bị bệnh đái tháo đường có thể giúp khôi phục nồng độ đường huyết [61].
2
Nguyễn Thị Minh Nguyệt
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Tiếp cận phương pháp đóng gói các tế bào có khả năng tiết insulin. Do đó, đề tài đặt ra những mục tiêu: Đóng gói các tế bào tiết insulin trong vỏ Alginate. Kiểm tra sự sống/chết của tế bào và chức năng tiết insulin của tế bào trong 15 ngày sau khi đóng gói.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tiết insulin
- Nguồn tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương (Messenchymal stem cell delivered from bone marrow_MSC-BM) là nguồn tế bào đông lạnh. Sau đó, MSC-BM được giải đông, nuôi cấy tăng sinh đồng thời kiểm tra tiềm năng bằng hai tiêu chí: sự biểu hiện một số marker đặc trưng cho dòng TBG trung mô; khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ.
- MSC-BM sau đó được biệt hóa thành tế bào tiết insulin và sự biểu hiện insulin sau quá trình cảm ứng biệt hóa.
Nội dung 2: Đóng gói tế bào tiết insulin vào vỏ Alginate
Quá trình thực hiện thí nghiệm đóng gói được tiến hành theo 2 bước.
Bước 1: Khảo sát vật liệu đóng gói Sodium alginate ở các nồng độ khác nhau về kích thước, khả năng thẩm thấu và bộ bền trước tác nhân gây phá hủy cấu trúc hạt.
Nồng độ thích hợp sẽ được sử dụng cho bước 2.
Bước 2: Kiểm tra tính chất tế bào trong vi hạt
- Kiểm tra chức năng tiết và khả năng trao đổi chất của tế bào in vitro bằng phương pháp MTT và kiểm tra sự hiện diện của insulin trong môi trường nuôi cấy sau 15 ngày.
- Kiểm tra chức năng tiết và sự sống sót của tế bào in vivo bằng phương pháp ghép lên mô hình chuột bị cao đường huyết và khảo sát trong 15 ngày, đồng thời thu nhận vi hạt sau 15 ngày kiểm tra MTT.

MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell-MSC) 3
1.1.1. Các nguồn thu nhận . 3
1.1.2. Nghiên cứu biệt hóa TBG trung mô thành tế bào tiết insulin . 3
1.2. Tiểu đường tuýp 1 (Diabetes type 1) 4
1.2.1. Sinh lý bệnh . 4
1.2.1.1. Giải phẫu học tuyến tụy . 5
1.2.1.2. Insulin 7
1.2.2. Các phương pháp điều trị bệnh tiểu đường hiện nay 7
1.2.2.1. Cấy ghép tụy 7
1.2.2.3. Cấy ghép tiểu đảo tụy . 8
1.2.2.4. Cấy ghép tế bào tiết insulin (insulin producing cells-IPC) 10
1.2.2.5. Phương pháp cô lập miễn dịch . 11
1.3. Công nghệ đóng gói tế bào và cô lập miễn dịch 13
1.3.1. Vật liệu đóng gói Alginate 15
1.3.2. Các phương pháp tạo vi hạt (đóng gói) . 19
1.3.2.1. Phương pháp đóng gói tĩnh điện (Electrostatic Encapsulation) . 20
ii
Nguyễn Thị Minh Nguyệt
1.3.2.2. Phương pháp đóng gói nhũ tương hóa (Emulsion Encapsulation) 21
1.3.2.3. Phương pháp đóng gói dòng chảy 21
1.3.3. Ứng dụng điều trị Bệnh tiểu đường tuýp 1 bằng cấy ghép tế bào tiết insulin được cô lập miễn dịch . 22
1.3.3.1. Lịch sử ứng dụng 22
1.3.3.2. Các phương pháp cấy ghép 23
1.3.3.3. Phương pháp đánh giá tế bào trong vi hạt 24
II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP 25
2.1. Hóa chất-dụng cụ . 25
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu . 25
2.1.2. Dụng cụ . 25
2.1.3. Thiết bị 26
2.1.4. Hóa chất và môi trường . 26
2.1.4.1. Hóa chất . 26
2.1.4.2. Môi trường . 27
2.2. Quy trình thực hiện 28
2.3. Phương pháp . 29
NỘI DUNG 1: CẢM ỨNG MSC-BM THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN 29
2.3.1. Phương pháp giải đông MSC-BM từ nguồn tế bào đông lạnh . 29
2.3.2. Phương pháp cấy chuyền, tăng sinh MSC-BM . 30
2.3.3. Phương pháp chứng minh tiềm năng biệt hóa của MSC-BM . 31
2.3.4. Phương pháp biệt hóa MSC-BM thành tế bào tiết insulin 34
NỘI DUNG 2 : ĐÓNG GÓI TẾ BÀO TIẾT INSULIN TRONG VỎ ALGINATE . 39
2.3.5. Phương pháp đóng gói tế bào vào vỏ Alginate . 40
iii
Nguyễn Thị Minh Nguyệt
2.3.6. Phương pháp kiểm tra khả năng sản xuất insulin của vi hạt trong điều kiện in vitro . 45
2.3.7. Phương pháp kiểm tra chức năng của tế bào đóng gói trong điều kiện in vivo 45
III. KẾT QUẢ 49
NỘI DUNG 1: CẢM ỨNG MSC-BM THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN 49
3.1. Kết quả giải đông MSC-BM từ nguồn tế bào đông lạnh 49
3.2. Kết quả chứng minh tiềm năng biệt hóa và marker của MSC-BM 49
3.2.1. Kết quả kiểm tra marker 49
3.2.1. Kết quả biệt hóa MSC-BM thành tế bào mỡ 51
3.3. Kết quả biệt hóa MSC-BM thành tế bào tiết insulin 51
3.3.1. Đánh giá sự biểu hiện mRNA . 53
3.3.2. Kết quả nhuộm tế bào tiết insulin bằng Dithizone 54
3.3.3. Kết quả định tính insulin trong môi trường nuôi cấy bằng HPLC/MS . 54
NỘI DUNG 2 : ĐÓNG GÓI TẾ BÀO TIẾT INSULIN TRONG VỎ ALGINATE . 56
3.4. Kết quả tạo vi hạt bằng vật liệu Alginate ở các nồng độ 1%, 1,5% và 2% 56
3.4.1. Kích thước vi hạt . 56
3.4.2. Khả năng thẩm thấu của vi hạt 57
3.4.3. Độ bền của vi hạt trước tác nhân Cation chelator . 58
3.5. Kết quả kiểm tra chức năng tiết của tế bào trong vi hạt ở điều kiện in vitro 59
3.5.1. Đánh giá mức độ chuyển hóa của tế bào trong vi hạt . 59
3.5.2. Kiểm tra chức năng tiết insulin của tế bào trong vi hạt 60
iv
Nguyễn Thị Minh Nguyệt
3.6. Kết quả kiểm tra chức năng tiết của tế bào đóng gói trong điều kiện in vivo (trên mô hình chuột cao đường huyết) 62
3.6.1. Kết quả tạo mô hình chuột bị cao đường huyết 62
3.6.2. Kết quả kiểm tra khả năng tiết insulin của tế bào đóng gói 63
3.6.3. Kết quả thu hồi vi hạt từ chuột 64
IV. BIỆN LUẬN . 65
NỘI DUNG 1: CẢM ỨNG MSC-BM THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN 65
4.1. Cảm ứng biệt hóa MSC-BM thành tế bào tiết insulin 65
NỘI DUNG 2 : ĐÓNG GÓI TẾ BÀO TIẾT INSULIN TRONG VỎ ALGINATE . 68
4.2. Khảo sát vật liệu đóng gói Sodium alginate . 68
4.3. Đánh giá chức năng tiết in vitro 69
4.4. Đánh giá chức năng tiết in vivo . 71
V. KẾT LUẬN 76
DANH MỤC CÔNG TRÌNH . ix
TÀI LIỆU THAM KHẢO . ii