Thạc Sĩ Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates

Luận văn thạc sĩ năm 2011
Đề tài: Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan .i
Lời cảm ơn .ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt v
Danh mục các hình ảnh vi
Danh mục các bảng .vii
Mở đầu. 1
Chương1 -Tổng quan 3
1.1. Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam .3
1.1.1. Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới .3
1.1.2. Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam .5
1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm (Lates calcarifer) ở thế giới 5
1.3.Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm ở Việt Nam .7
1.4. Một vài đặc điểm vi khuẩn V. alginolyticus 8
1.4.1. Hệ thống phân loại của V. alginolyticus 8
1.4.2. Đặc điểm phân bố của V. alginolyticus .8
1.4.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của V. alginolyticus 9
1.4.4. Yếu tố gây độc của V. alginolyticus 11
ChươngII: Phương pháp nghiên cứu 14
2.1. Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu 14
2.2.1. Phương pháp thu thập, lưu giữ và phục hồi chủng 14
2.2.2Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 14
2.2.3. Nghiên cứu độc lực, LD
50
của vi khuẩn 16
2.2.3.1. Chuẩn bị vi khuẩn kiểm tra độc lực 16
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm .17
2.2.3.3. Phân lập lại vi khuẩn .18
iv
2.2.4. Phương pháp phân tích thành phần protein và lipopolysaccharides (LPS)
của vi khuẩn 19
2.2.4.1. Phương pháp nhuộm Pr 20
2.2.4.2. Phương pháp nhuộm LPS .21
2.3. Phương pháp xủ lý số liệu .22
ChươngIII: Kết quả nghiên cứu 23
3.1. Đặc điểm sinh hóa và hính thái của 4 chủng V. alginolyticusgây bệnh lở loét
trên cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa 23
3.2 Kết quả kiểm tra độc lực của 4 chủng V. alginolyticus .25
3.2.1 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CH10 26
3.2.2 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoS01 .28
3.2.3 Kết quả kiểm trađộc lực chủng CoK03 30
3.2.4 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoVL03 31
3.2.5. Kết quả phân lập trở lại V. alginolyticus 32
3.2.6. Kết quả kiểm tra độc lực 4 chủng V. alginolyticusđợt 2 33
3.3 Thành phần Protein và LPS của 4 chủng V. alginolytics 35
3.3.1.Thành phần Protein của 4 chủng V. alginolytics .35
3.3.2. Kết quả phân tích LPS của 4 chủng V. alginolytics 37
ChươngIV: Kết luận và đề xuất ý kiến .38
4.1. Kết luận 38
4.2. Đề xuất ý kiến 38
Tài liệu tham khảo 39
Phụ lục .

MỞ ĐẦU
Nghề nuôi cá biển Việt Nam trong vài năm trở lại đây đã phát triển mạnh mẽ. Nhiều
đối tượng cá biển được đưa vào nuôi với nhiều hình thức nuôi ao đìa hoặc nuôi lồng, bè.
Trong đó, cá chẽm với nhiều ưu điểm như lớn nhanh, phân bố rộng muối, có giá trị kinh
tế, và đã được nghiên cứu sản xuất giống nhân tạo thành công, nên nghề nuôi cá chẽm đã
phát triển mạnh ở khu vực miền Trung (Khánh Hòa, Phú Yên) và một số nơi ở phía Bắc
như Hải Phòng, Quảng Ninh Đến nay cá chẽm trở thành đối tượng nuôi xóa đói giảm
nghèo, thay thế các đối tượng nuôi khác đang bị suy thoái. Tuy nhiên, trong quá trình
nuôi do kỹ thuật chăm sóc, quản lý môi trường còn nhiều hạn chế nên nghề nuôi cá chẽm
đang đối mặt với nhiều đợt dịch bệnh gây thiệt hại kinh tế cho người nuôi.
Trong thời gian gần đây, cá chẽm nuôi thương phẩm ở vùng biển Vũng Ngán -Nha Trang bị bệnh lở loét trên thân với tốc độ lây lan nhanh, gây chết khoảng 80% trong
vòng 1 tuần, bệnh xảy ra ở tất cả các cỡ cá nuôi, từ cá mới thả nuôi cho đến cá đã nuôi lớn
(2 -3kg). Nguyên nhân ban đầu xác định do vi khuẩn Vibrio alginolyticusgây ra.
Trước tình hình thực tế trên và để có cơ sở cho việc xác định chính xác tác nhân
gây bệnh, nghiên cứu vaccin phòng bệnh trên cá biển nuôi, tôi đề xuất thực hiện đề tài: “
Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticusphân lập từ
cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các b è nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa”.
Mục tiêu của đề tài:
Xác định mối tương quan giữa độc lực và thành phần protein của chủng vi khuẩn
V.alginolyticusphân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét để làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất
vaccin phòng bệnh trên cá biển nuôi, giúp giảm thiệt hại và nâng cao hiệu quả kinh tế cho
nghề nuôi cá biển.
Nội dung thực hiện đề tài:
1. Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn V.alginolyticus
2. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn V.alginolyticus
3. Xác định thành phần protein của chủng vi khuẩn V.alginolyticus
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2
Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ bổ sung vào nguồn tư liệu các nghiên cứu
cơ bảnvề chủng vi khuẩn V.alginolyticus gây bệnh lở loét trên cá chẽm: đặc điểm sinh
hóa, độc lực và thành phần protein.
Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ làm cơ sở cho nghiên cứu sản
xuất vaccin phòng bệnh trên cá chẽm cũng như các đối tượng cá biển nuôi thương phẩm ở
nước ta.
3
ChươngI: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam
1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới
Cá chẽm có giá trị dinh dưỡng cao, là loài phân bố rộng vàdễ nuôi nên đã trở
thành một trong những đối tượng được lựa chọn để phát triển nuôi chính cho ngành nuôi
trồng thủy sản ở nhiều nước trong khu vực. Kỹ thuật nuôi cá chẽm được phát triển lần đầu
tiên ở phòng thí nghiệm Songkhla Marine (Thái Lan) từ những năm đầu của thập niên
1970 và sau đó phát triển rộng ra các nước trong khu vực như Trung Quốc, Ấn Độ,
Indonesia, Malaysia, Phillipines, Singapore, Đài Loan, Việt Nam và Australia, và gần đây
ở một số quốc gia như Mỹ, Hà Lan, Anh và Israel [35].
Từ năm 1997 đến năm 2006, sản lượng cá chẽm hàng năm ở khu vực châu Á -Thái Bình Dương luôn ở trong khoảng từ 20.000 -27.000 tấn, phần lớn cá chẽm được
nuôi hồ hoặc lồng ở vùng nước lợ cửa sông hoặc bờ biển [36]. Năm 2004, sản lượng cá
chẽm khoảng 25.399 tấn, năm 2005 khoảng 26.584 tấn [61]và năm 2006 tăng lên 27.522
tấn [62].

TÀILIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2005). Tổng quan về các bệnh nguy hiểm
thư ờng gặp trên động vật nuôi biển, Báo cáo đề tài khoa học. Viện Nghiên Cứu
NTTS II, TP. Hồ Chí Minh.
2. Đỗ Thị Hoà (2003), “ Phương pháp chẩn đoánbệnh do vi khuẩn ở động vật thuỷ sản”.
Bài giảng thực hành bệnh vi khuẩn. Trường ĐH Nha Trang, Khánh Hoà.
3. Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh
học thuỷ sản. NXB Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.
4. Đỗ Thị Hòa, Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị
Nguyệt Huệ, 2008. Các loại bệnh thường gặp trên các biển nuôi ở Khánh Hòa.
Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, số 02, Trường Đại học Nha Trang, trang
16 -24.
5. Nguyễn Ngọc Nhiên (1992). Sổ tay thí nghiệm bệnh cá vi sinh(d ịch từ bảng gốc
của J.A. Plumb & P.R. Bower). Bộ thủy sản, Hà Nội.
6. Bùi Quang Tề (1995). Thực hành chuẩn đoán bệnh tôm cá. Viện Nghi ên Cứu NTTS
I, Bộ Thủy Sản, Hà Nội
7. Nguyễn Thị Thanh Thuỳ (2005). Tìm hi ểu bệnh lở loét ở cá mú (Serrranidea) nuôit ại
Khánh Hoà. Luận văn Thạc sĩ, Viện Nghiên C ứu NTTS III, Khánh Hoà.
8. Viên Đại Phúc (2011). Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates
calcarifer) nuôi lồng biển tại Nha Trang –Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Viện
Nghiên Cứu NTTS III, Khánh Hoà.
Tài liệu tiếng Anh
9. Aguirre-Guzmán G, H. Mejia Ru›z, F. Ascencio (2004). A review of extracellular
virulence product of Vibrio species important in diseases of cultivated shrimp .
Aquac Res 35:1395–1404.
10. AkayliT., G. Timur, B. Aydemir, A.R. Kiziler, O. Coskun, G. Albayrak và E.
Arican (2008). Characterization of Vibrio alginolyticus Isolates from Diseased
Cultured Gilthead Sea Bream, Sparus aurata. The Israeli Journal of Aquaculture –
Bamidgeh 60(2), 2008, 89-94.
40
11. Amel Ben Kahla-Nakbi, K. Chaieb, A.Bakhrouf (2009). Investigation of several
virulence properties among Vibrio alginolyticus strains isolated from diseased
cultured fish in Tunisia. Diseases of aquatic organisms. Vol. 86: 21–28.
12. Austin B., L.F. Stuckey, A.W. Robertson, I. Effendi vàD.R.W. Griffith (1995b).
A probiotic strain of Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases caused by
Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii. J. Fish Dis.,
18(1):93-96.
13. Austin B. và D. A. Austin (2007). Bacterial Fish Pathogens. Diseases of Farmed
and Wild Fish. Fourth Edition. Springer.
14. Avendan ˜o-Herrera R., J. Rodrı ´guez, B. Magarin ˜os, J.L. Romalde,A.E.
Toranzo (2004b). Intraspecific diversity of the marine fish pathogen
Tenacibaculum maritimum as determined by randomly amplified polymorphic
DNA-PCR. J. Appl. Microbiol. 96, 871–877.
15. Balebona M.C., M.J.Andreu, M.A. Bordas, I. Zorrilla, M.A. Morinigo vàJ.J.
Borrego (1998a). Pathogenicity of Vibrio alginolyticus for cultured gilt-head sea
bream(Sparus aurataL.). Appl. Environ. Microbiol., 64(11): 4269-4275.
16. Balebona M. C., I. Zorrilla, M. A. Moriñigo, J. J. Borrego (1998b). Survey of
bacterial pathologies affecting farmed gilt-head sea bream (Sparus aurata L.) in
southwestern Spain from 1990 to 1996.Aquaculture 166:19–35.
17. BercovierH., C.Ghittino, A. Eldar(1997). Immunization with bacterial antigens:
infections with streptococci and related organisms. In: Gudding, R., Lillehaug, A.,
Midtlyng, P.J., Brown, F. (Eds.), Fish Vaccinology. Karger, Basel, Switzeland, pp.
153–160.
18. Bromage E. S., A. Thomas, L. Owens(1999), Streptococcus iniae, a bacterial
infection in Barramundi Lates calcarifer. Dis Aqua Org, Vol. 36: 177-181.
19. Cai J. , H. Han, Z. Song, C. Li, J . Zhou(2006). Isolation and characterization of
pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased postlarval abalone, Haliotis
diversicolor supertexta (Lischke). Aquac Res 37:1222–1226.
20. ChenM.F., D.Henry-Ford, J.M. Groff(1995). Isolation of Flexibacter maritimus
from California,FHS/AFS Newsl. 22, 7–11.
41
21. Chuan-fu D., L. Tian-long, X. Bin-fu, G. Hui, L. Neng-feng, (07 -2004).
Electrophoretic and immunobot analysis of the major outer membrane protein
(MOMP) and polysaccharides antigen(PSA) of Vibrioparaheamolyticus and Vibrio
alginolticus. Chinese Journal of Zoonoses. (Institute of Animal Husbandry and
Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou
350003,China).
22. Colorni A., I. Paperna vàH. Gordin (1981), Bacterial infections in gilt-head sea
bream Sparus auratacultured at Eilat,Aquaculture, 23:25-267.
23. Colorni A., A.Diamant, A. Eldar, H. Kvitt và A. Zlotkin (2002). Streptococcus
iniae infections in red seacage -cultured and wild fishes. Dis. Aquat. Org. 49, 165–
170.
24. Devesa S., J.L.Barja, A.E. Toranzo (1989).Ulcerative and skin and fin lesions in
reared turbot (Scophthalmus maximus L.).J. Fish Dis. 12, 323–333.
25. Ding T. , L. Tian-long, X. Bin-fu (01-2011). Comparative Characteristics of
Outer Membrane Proteins in Bacteria Vibrio vulnificus and V.alginolyticus.
Fisheries Science (Biotechnology Institute,the Fujian Academy of Agricultural
Sciences,Fuzhou 350003,China).
26. Edward J.,M.S.Noga vàD.V.M. (2010). Fish disease diagnosis and treatments.
Second edition. WILEY-BLACKWELL, A John Wiley & Sons, Inc., Publication,
519 pages.
27. Eldar A., P.F.Frelier, L.Assenta, P.W.Varner, S.Lawhon, H.Bercovier(1995).
Streptococcus shiloi, the name for an agent causing septicemic infection in fish, is
a junior synonym of Streptococcus iniae. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 840–842.
28. Eldar A., S.Perl, P.F.Frelier, H.Bercovier(1999b). Red drum Sciaenops ocellatus
mortalities associated with Streptococcus iniae infection. Dis. Aquat. Org. 36,
121–127.
29. Eldar A. vàC. Ghittino (1999). Lactococcus garvieae and Streptococcus iniae
infections in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: Similar, but different diseases.
Disease of Aquatic Organisms 36, 227-231.
42
30. Esteve C. , E. G. Biosca , C. Amaro(1993). Virulence of Aeromonas hydrophila
and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in
fresh water. Dis Aquat Org 16:15–20.
31. Faddin M.J.F. (1980). Biochemical tests for indentification of medical bacteria,
Wiliam & Wilkins, USA.
32. FAO, Cultured Aquatic Spec ies In for mation Progr amme : Lates calcarifer
(Block , 1790),(on-line), FAO. Truy cập ngày 12/12/2009 tại địa chỉ
(http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Lates_calcarifer/en).
33. Frerichs, G.N. (1993), Manual for the isolation and identification of fish bacterial
pathogens, Pisces Press -Stirling.
34. Gjerde J., vàB. Boe. (1981). Isolation and characterization of Vibrlo alginolyticus
and Vibrio parahaemolyticus from the Norwegian coastal environment. Acta Vet.
Scand. 22:331-343.
35. Glenn S., J .Bosmans và J.Humphrey (2007). Nothern Territory Barramundi
Handbook,80 pp. (on -line), truy cập ngày 25/12/2009 tại địa chỉ
(http://www.nt.gov.au/d/Fisheries/Content/File/NT_Barra_Farming_Handbook_O
nline_1107.pdf).
36. Halwart M., D. Soto,J.R. Arthur (2007). Cage aquaculture -Regional reviews and
global overview. FAO Fisheries Technical Paper. No. 498. Rome, FAO. 241 pages.
37. Handlinger J., H.Soltani, V. Percival (1997). The pathology of Flexibacter
maritimus in aquaculture species of Tasmania, Australia. J. Fish Dis. 20, 159–
168.
38. Hoa T.T.T., D.T.H. Oanh và N.T.Phuong(2001). Characterization and
Pathogenicity of Vibrio Bacteria Isolated from Freshwater Prawn
(Macrobrachium rosenbergii) Hatcheries, Part 1:Isolation and Identification of
Vibrio sppfrom Larval Stages.
39. Holt J. G., N. R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, S. T. Williams (1994).
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition, Williams &
Wilkins, 787 pp.