Luận Văn Dịnh danh nhóm nấm Trichoderma spp Phân lập tại Việt Nam

MỤC LỤC


TÓM TẮT . iv


ABSTRACT vi


MỤC LỤC . vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .x


DANH SÁCH CÁC BẢNG . xii


DANH SÁCH CÁC HÌNH xii


Chương 1 .0


MỞ ĐẦU .0


1.1. Đặt vấn đề 0


1.2. Mục đích 0


1.3. Yêu cầu 0


Chương 2 .2


TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2


2.1. Giới thiệu về nấm Trichoderma .2


2.1.1. Phân loại .2


2.1.2. Nguồn gốc 2


2.1.3. Đặc điểm hình thái .3


2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học .4


2.1.5. Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng .4


2.2. Cấu tạo tế bào Trichoderma .6


2.3. Các phương pháp định danh tên loài nấm Trichoderma 7


2.4. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA .9


2.5. Giới thiệu về vùng tef1 .10


2.6. Phương pháp định lượng nồng độ DNA bằng phân tử Mass .10


2.7. Các nghiên cứu có liên quan đến Trichoderma và vùng rDNA 11


2.8. Các nghiên cứu có liên quan đến định danh và phân nhóm Trichoderma .13


Chương 3 .15


VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 15


3.1. Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 15


3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .15


3.1.2. Đối tượng nghiên cứu 15


3.2. Hoá chất .16


3.3. Dụng cụ và thiết bị .17


3.4. Phục hồi các dòng Trichoderma. .17


3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma 17


3.6. Ly trích DNA tổng số Trichoderma .18


3.7. Kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA .18


3.8. Phản ứng PCR 19


3.9. Đánh giá kết quả PCR .21


3.10. Định danh tên loài các dòng Trichoderma .22


3.11. Phân nhóm tạo phổ hệ di truyền 24


3.12. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu


của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới 24


Chương 4 .25


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .25


4.1. Kết quả ly trích DNA .25


4.2. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 .26


4.3. Kết quả định danh tên loài .27


4.4. Kết quả phân nhóm tạo phổ hệ di truyền .35


4.4.1. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1


35


4.4.2. Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA 37


4.5. So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với dữ liệu của chúng trên NCBI 39


4.6. Xác định mối quan hệ di truyền của vùng ITS – rDNA và một phần vùng


tef1 với dữ liệu của chúng trên thế giới .41


Chương 5 .44


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .44


5.1. Kết luận 44


5.2. Đề nghị .44


TÀI LIỆU THAM KHẢO


PHỤ LỤC


DANH SÁCH CÁC BẢNG


Bảng 3. 1 Các dòng nấm sử dụng để định danh và phân nhóm trong đề tài .15


Bảng 3. 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng .20


Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lượng dùng cho một phản ứng .21


Bảng 3. 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR .21


Bảng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI .22


Bảng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dòng Trichoderma trên NCBI .23


Bảng 4. 1 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T37 với các loài trên NCBI 28


Bảng 4. 2 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T42 với các loài trên NCBI 28


Bảng 4. 3 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T38 với các loài trên NCBI 29


Bảng 4. 4 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T19 với các loài trên NCBI 29


Bảng 4. 5 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T33 với các loài trên NCBI 30


Bảng 4. 6 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T2 với các loài trên NCBI 30


Bảng 4. 7 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T14 với các loài trên NCBI 31


Bảng 4. 8 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T85 với các loài trên NCBI 31


Bảng 4. 9 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T88 với các loài trên NCBI 32


Bảng 4. 10 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T6 với các loài trên NCBI .32


Bảng 4. 11 Độ tương đồng di truyền (%) dòng T68 với các loài trên NCBI .33


Bảng 4. 12 Kết quả định danh tên loài các dòng Trichoderma của đề tài .33


DANH SÁCH CÁC HÌNH


Hình 2. 1 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên môi trường PDA


sau 2 – 3 ngày nuôi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh) .3


Hình 2. 2 Kết quả Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dòng có mã số truy cập là


AF 3362109 trên NCBI .9


Hình 3. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị


trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5 .20


Hình 3. 2 Sơ đồ các primer trên toàn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh


dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F 20


Hình 4. 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích được, trên gel agarose


1 % ở 110V, 400A trong 20 phút 26


Hình 4. 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích được sau khi pha


loãng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút 26


Hình 4. 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút, sản


phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có


kích thước 600 bp 27


Hình 4. 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản


phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1với cặp primer EF1 – 728R và


EF1 – 986F, có kích thước 320bp .27


Hình 4. 5 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS – rDNA (A) và một phần vùng


tef1 (B) .36


Hình 4. 6 Kết quả phân nhóm từ trình tự vùng ITS1– rDNA (A) và ITS2– rDNA (B)


.38


Hình 4. 7 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS1(A) và ITS2– rDNA (B) với dữ liệu


của chúng trên thế giới. .40


Hình 4. 8 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dòng Trichoderma .


Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới .43


Hình 4. 9 Kết quả so sánh trình tự một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma


Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới .42