Luận Văn định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng its – rdna và vùng tef

TÓM TẮT


“ĐỊNH DANH NẤM Trichoderma DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG ITS – rDNA VÀ VÙNG TEF”


Nội dung nghiên cứu:


- Phục hồi các dòng nấm Trichoderma được phân lập từ những địa điểm khác


nhau ở Việt Nam (10 mẫu), các mẫu này chỉ được định danh dựa vào hình thái


học của các dòng nấm và những dòng Trichoderma của nước ngoài (10 mẫu)


từ những ống nghiệm chứa bào tử.


- Nhân sinh khối, thu sinh khối nấm.


- Ly trích thu DNA.


- Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS1 – 5,8 – ITS2 bằng primer


ITS4, ITS5 và khuếch đại vùng tef1 – tef2 bằng primer ElongR, ElongF của


các dòng nấm Trichoderma .


- Đọc trình tự sản phẩm PCR của dòng Trichoderma trên cả vùng khuếch đại


bằng cặp primer ITS4, ITS5 và cặp primer Elong R, Elong F; so sánh với cơ


sở dữ liệu (NCBI) để đánh giá mức độ tương đồng của vùng ITS1-5,8-ITS2 và


vùng tef1 – tef2 từ đó xác định chính xác tên loài của từng dòng nấm.


Kết quả đạt được:


- Tất cả 20 dòng nấm Trichoderma của Việt Nam và nước ngoài đều phục hồi và


thu được sinh khối cần cho ly trích DNA nhân sôi nấm.


- Ly trích DNA tổng số.


- Chạy PCR bằng cặp primer ITS4, ITS5 và cặp primer Elong R, Elong F trên 4


dòng T.harzianum (T4), T.koningii (T6), T.asperellum (T19), Trichoderma spp. (2

T.harzianum (T4), T.koningii (T6), T.asperellum (T19), Trichoderma spp. (2


– 41 – 2) và dòng T.harzianum (GJS 00-39 – mẫu Trichoderma của nước ngoài đã

– 41 – 2) và dòng T.harzianum (GJS 00-39 – mẫu Trichoderma của nước ngoài đã


được định danh) dùng làm mẫu đối chứng

được định danh) dùng làm mẫu đối chứng


- Tiến hành khuếch đại vùng rDNA – ITS và vùng Tef với 2 cặp primer: ITS1-


ITS2 thu được sản phẩm khuếch đại có kích thước 670 bp (căn cứ trên thang


ladder), tương tự như trên đối với cặp primer: ElongR, ElongF thu được sản phẩm


khuếch đại có kích thước 260 bp (căn cứ trên thang ladder) trên 4 dòng


Trichoderma của Việt Nam và 1 dòng đối chứng của nước ngoài Trichoderma


harzianum.


- Giải được trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 và vùng Tef của dòng Trichoderma


harzianum (T4)


- So sánh trình tự DNA vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 giữa dòng Trichoderma nghiên


cứu với những dòng Trichoderma trên cơ sở dữ liệu NCBI và dựa vào phần mềm


CLUSTALX.


 Khẳng định T4: Trichoderma asperellum.


 Kích thước của vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 là 54 5bp.


 Kích thước vùng Tef là 223bp.


 Trình tự nucleoted ở vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 của dòng Trichoderma


asperellum (T4) của Việt Nam so với dòng Trichoderma asperellum có mức độ


tương đồng là 98%.


 Trình tự nucleoted ở vùng Tef1fw – Tef2rev của dòng Trichoderma


asperellum (T4) của Việt Nam so với dòng Trichoderma asperellum có mức độ


tương đồng 98%.


MỤC LỤC


Trang tựa


Lời cảm ơn . .iii


Tóm tắt iv


Mục lục vi


Danh sách chữ viết tắt . x


Danh sách các bảng và hình xi


PHẦN 1: GIỚI THIỆU VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1 Đặt vấn đề . 1


1.2 Mục đích nghiên cứu 2


1.3 Yêu cầu . 2


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


2.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma. 3


2.1.1 Phân loại . 3


2.1.2 Nguồn gốc 3


2.1.3 Đặc điểm hình thái . 3


2.1.4 Đặc điểm sinh thái . 4


2.1.5 Cơ chế tác động của nấm trichoderma lên các nấm


gây bệnh cho cây trồng . 5


2.1.6 Cơ chế đối kháng của trichoderma: 6


2.1.6.1 Kháng sinh 6


2.1.6.2 Ký sinh . 7


2.1.6.3 Cạnh tranh . 7


2.1.7 Ứng dụng của nấm Tricoderma trong các lĩnh vực . 8


2.1.7.1 Lương thực và nguyên liệu sợi . 8


2.1.7.2 Chất sinh học . 8


2.1.7.3 Chất giúp tăng sự phát triển của cây 9


2.1.7.4 Như là nguồn trao đổi thông tin di truyền. 10


2.2 TỔNG QUAN VỀ ITS – rDNA . 10


2.2.1 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS . 10


2.2.2 Lịch sử nghiên cứu rDNA 12


2.2.3 Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền 13


2.2.4 Nghiên cứu trên vùng rDNA-ITS và vùng Tef của nấm Trichoderma . 13


2.3. GIỚI THIỆU KỸ THUẬT PCR . 14


2.3.1 Giới thiệu sơ lược về phản ứng PCR 14


2.3.1.1 Khái niệm . 15


2.3.1.2 Nguyên tắc . 15


2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng . 17


2.3.2.1 DNA khuôn . 17


2.3.2.2 Enzyme . 17


2.3.2.3 Primer và nhiệt độ lai . 17


2.3.2.4 Các thành phần khác trong phản ứng PCR . 18


2.3.2.5 Số lượng chu kỳ phản ứng . 18


2.3.2.6 Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR . 18


2.3.3 Ứng dụng của PCR . 18


2.4. GIỚI THIỆU SƠ LưỢC VỀ KỸ THUẬT DNA SEQUENCING 20


2.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NưỚC 21


2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THẾ GIỚI 22


2.7 HưỚNG PHÁT TRIỂN TưƠNG LAI TRÊN CÁC DÕNG


NẤMTRICHODERMA (HARMAN 2000) . 22


PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


3.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TưỢNG NGHIÊN CỨU 24


3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 24


3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 24


3.2 HOÁ CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM . 26


3.2.1 Hóa chất . 26


3.2.1.1 Môi trường để lưu trữ nguồn nấm . 26


3.2.1.2 Môi trường để phục hồi nhanh dòng nấm 26


3.2.1.3 Hoá chất cần cho dung dịch nhân sinh khối nấm 26


3.2.1.4 Hoá chất cần cho tách chiết DNA sợi nấm . 26


3.2.1.5 Hoá chất sử dụng trong điện di . 27


3.2.1.6 Hoá chất cho phản ứng PCR . 27


3.2.1.7 Hoá chất trong tinh sạch sản phẩm PCR . 27


3.2.2 Dụng cụ và thiết bị . 27


3.3 PHỤC HỒI CÁC DÕNG NẤM TRICHODERMA . 28


3.4 NHÂN SINH VÀ THU SINH KHỐI NẤM . 28


3.5 LY TRÍCH DNA TỪ NẤM ĐÃ ĐưỢC NGHIỀN MỊN 29


3.6 KIỂM TRA KẾT QUẢ LY TRÍCH DNA VÀ PHA LOÃNG DNA . 30


3.7 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI VÙNG ITS-rDNA, TEF


CÁC DÕNG NẤM TRICHODERMA 31


3.7.1 Vật liệu và thành phần hoá chất cho phản ứng PCR 31


3.7.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR (Wang C. Z., 2002) 33


3.7.3 Đánh giá kết quả PCR 33


3.8 ĐỌC TRÌNH TỰ SẢN PHẨM PCR 35


3.8.1 Chuẩn bị DNA khuôn . 35


3.8.1.1 Tinh sạch sản phẩm PCR . 35


3.8.1.2 Định lượng sản phẩm PCR đã tinh sạch 38


3.8.2 Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer 38


PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


4.1 Kết quả phục hồi nấm Trichoderma từ những ống nghiệm chứa những bào tử


nấm 39


4.2. Kết quả ly trích thu DNA từ các dòng nấm Trichoderma . 40


4.3 Kết quả khuếch đại vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 41


4.4 Pha loãng sản phẩm PCR đã được tinh sạch 42


4.5 Sản phẩm PCR tinh sạch của dòng Trichoderma harzianum . 43


4.6 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA và vùng Tef 43


4.6.1 So sánh trình tự nucleotid giữa vùng ITS – rDNA và vùng Tef . 43


4.6.2 Kết quả giải trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 48


4.6.3 Kết quả giải trình tự vùng Tef1fw –Tef2rev của dòng T4 50


PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ


5.1 Kết luận 51


5.2 Đề nghị 52


5.3 Hạn chế đề tài . 52


Tài liệu tham khảo . 53


Phụ lục 55