Luận Văn Định danh loài Gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát triển của ấu trù

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Định danh loài Gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát triển của ấu trùng Gnathostoma sp trong ký chủ trung gian


MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU . v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ vi
LỜI MỞ ĐẦU . 1
Đặt vấn đề 1
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài . 2
CHƯƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. Đặc điểm chung Gnathostoma sp 4
1.1.1. Hình thái cấu tạo 4
1.1.2. Vòng đời phát triển 5
1.1.3. Sức đề kháng . 6
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng . 6
1.1.5. Điều trị 6
1.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma ở Việt Nam và
trên Thế giới . 7
1.2.1. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma ở Việt Nam . 7
1.2.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma trên Thế
giới . . 8
1.3. Đặc điểm sinh học của các ký chủ nghiên cứu 11
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Mesocyclops leuckarti . 11
ii
1.3.2. Đặc điểm sinh học của lươn . 12
1.3.3. Đặc điểm sinh học của cá lóc . 13
1.3.4. Đặc điểm sinh học của ếch . 13
1.4. Phản ứng PCR 14
1.4.1. Nguyên lý của phản ứng PCR 14
1.4.2. Phân loại phản ứng PCR 17
1.4.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR 22
1.4.3.1.Các loại mẫu DNA làm khuôn . 23
1.4.3.2.Enzym DNA – polymerase 23
1.4.3.3.Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi . 24
1.4.3.4.I–on Magiê (Mg
2+
) . 25
1.4.3.5.Thành phần dNTP 25
1.4.3.6.Nước 25
1.4.3.7.Thời gian và số lượng chu kỳ của phản ứng PCR . 25
1.4.3.8.Yếu tố nhiệt độ của chu trình nhiệt . 26
1.4.4. Phát hiện sản phẩm PCR 26
1.4.5. Độ tin cậy của phương pháp PCR 28
CHƯƠNG 2: ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 28
2.1. Địa điểm nghiên cứu . 28
2.2. Nội dung nghiên cứu . 29
2.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu 29
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 29
2.3.2. Trang thiết bị . 29
iii
2.3.3. Các loại hóa chất 29
2.4. Phương pháp nghiên cứu . 30
2.4.1. Phương pháp thu thập mẫu và xác định hình thái học . 30
2.4.2. Phương pháp giám định loài bằng PCR 30
2.4.3. Phương pháp xét nghiệm cá lóc, lươn và ếch . 32
2.4.4. Phương pháp gây nhiễm G. spinigerum . 33
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lươn, ếch . 34
3.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma dựa vào hình thái học 35
3.2.1. Định danh loài Gnathostoma phân lập từ cá lóc, lươn và ếch . 35
3.2.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma phân lập được ở chó . 36
3.3. Kết quả xác định loài bằng kỹ thuật PCR 39
3.4. Kết quả nghiên cứu các giai đoạn phát triển của G. spinigerum 40
3.4.1. Các giai đoạn phát triển trứng G. spinigerum đến ấu trùng kỳ 2 . 40
3.4.2. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclops
leuckarti 42
3.4.3. Kết quả gây nhiễm ấu trùng G. spinigerum cho cá lóc, lươn và ếch 45
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN . 47
4.1. Kết quả 47
4.2. Đề xuất ý kiến 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu Tên viết tắt
G. spinigerum G = Gnathostoma
N Tổng số mẫu
L1, L2, L3 Ấu trùng kỳ 1, 2, 3
PCR
Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng chuỗi trùng hợp –
phản ứng khuếch đại gen)
DNA Deoxyribonucle Acid
RNA Ribonucle Acid
v
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Trang
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng L3 Gnathostoma sp ở cá lóc, lươn và ếch tại
tỉnh Khánh Hòa 34
Bảng 3.2. Kích thước ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập được 35
Bảng 3.3. Số móc trên hành đầu của ấu trùng L3 Gnathostoma sp 35
Bảng 3.4. So sánh số móc trên hành đầu của 4 loài Gnathostoma 36
Bảng 3.5. Kích thước giun Gnathostoma sp phân lập được ở chó 36
Bảng 3.6. Số móc trên hành đầu giun Gnathostoma sp phân lập được ở chó . 37
Bảng 3.7. Kết quả xác định loài bằng dựa vào hình thái cấu tạo và bằng PCR39
Bảng 3.8. Quá trình phát triển trứng G. spinigerum thành ấu trùng kỳ 2 40
Bảng 3.9. Kích thước ấu trùng kỳ 2 G.spinigerum . 40
Bảng 3.10. Hình thái ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclops leuckarti . 42
Bảng 3.11. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng G. spinigerum ở cá lóc, lươn, ếch qua gây
nhiễm thực nghiệm 45
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ
Trang
Hình 1.1. Hình thái cấu tạo Gnathostoma sp . 4
Hình 1.2. Vòng đời phát triển của Gnathostoma sp . 5
Hình 1.3. Giun Gnathostoma sp tạo thành khối U trong dạ dày chó 6
Hình 1.4. Hình thái Mesocyclops leuckarti . 11
Hình 1.5. Sơ đồ PCR . 17
Hình 3.1. Hình thái ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập được . 35
Hình 3.2. Giun Gnathostoma sp phân lập ở chó 37
Hình 3.3. Trứng Gnathostoma sp 37
Hình 3.4. Kết quả PCR 39
Hình 3.5. Các giai đoạn phát triển trứng G.spinigerum 42
Biểu đồ 3.1. Liên quan giữa kích thước ấu trùng và cường độ nhiễm ở
Mesocyclopsleuckarti . 44
Hình 3.6. Hình thái ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclopsleuckarti . 44
Biểu đồ 3.2. Dao động kích thước ấu trùng L3 theo thời gian 45
Hình 3.7: Hình ảnh gây nhiễm cá lóc, lươn, ếch . 46
1
LỜI MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Gnathostomiasis là bệnh ký sinh trùng lây truyền từ động vật sang người
do loài giun tròn Gnathostoma sp gây ra. Có 12 loài gây bệnh trên động vật đã
được ghi nhận, G. spinigerum, G. hispidum, G. turgidum, G.doloresi, G.
nipponicum, G. americanum, G. procyonis, G. miyazakii, G. malaysiae, G.
vietnamicum, G. didelphis và G.brasiliense (Daengsvang, 1980; Miyazaki,
1991). Trong đó có 4 loài gây bệnh trên người là G.spinigerum, G.hispidum,
G.doloresi và G.nipponicum. Tỷ lệ nhiễm G. spinigerum cao được thông báo ở
các nước Châu Á như: Thái Lan, Nhật Bản, Malaysia, Ấn Độ, Trung Quốc,
Philippines, Indoneaia và Việt Nam. Người đầu tiên nhiễm Gnathostoma sp ở
Việt Nam được phát hiện năm 1963, trong những năm gần đây có nhiều trường
hợp nhiễm mới được phát hiện (Lê Thị Xuân, 2003; Trần Phú Mạnh Siêu,
2010).
Vòng đời của Gnathostoma sp đã được thông báo trước đây
(Daengsvang, 1972). Giun trưởng thành sống trong khối U của dạ dày của vật
chủ cuối cùng (lợn, chó, mèo), trứng theo phân ra ngoài môi trường với điều
kiện nhiệt độ, ẩm độ thích hợp, ấu trùng sẽ thoát khỏi vỏ trứng, xâm nhập vào
vật chủ trung gian thứ nhất (các loài giáp xác thuộc họ Cyclopidae). Khi vật
chủ trung gian thứ 2 (các loài cá nước ngọt, ếch, lươn) ăn phải vật chủ trung
gian thứ nhất (Cyclops), ấu trùng tiếp tục phát triển đến giai đoạn ấu trùng kỳ
3. Người hoặc lợn, chó, mèo nhiễm bệnh do ăn phải ấu trùng kỳ 3 này.
Việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, trong đó có
ký sinh trùng ở động vật cho đến gần đây chủ yếu vẫn dựa vào xác định đặc
tính hình thái học và nuôi cấy. Mặc dầu hình thái học (kiểu hình) trong phân
loại là rất thông dụng và đã có những thành tựu hết sức to lớn, nhưng trong
nhiều trường hợp khó khăn gặp phải là khó phân biệt loài và dưới loài một cách
chính xác (McCarthya, Moore, 2000). Do tiêu tốn thời gian và khó tìm kiếm
đúng môi trường thích hợp nuôi cấy cho một số loại vi khuẩn/virus, hay vật chủ
cho ký sinh trùng, bệnh phẩm đòi hỏi phải hoàn chỉnh hoặc phải ở trạng thái
sống, nên các phương pháp chẩn đoán dựa trên nuôi cấy và hình thái học có rất
2
nhiều hạn chế (Mori và Notomi, 2009). Các phương pháp chẩn đoán truyền
thống áp dụng trong lâm sàng và dịch tễ học như xét nghiệm tìm trứng/ấu trùng
hay các sản phẩm của ký sinh trùng hoặc các kỹ thuật miễn dịch học đều có
những sai số nhất định, tuỳ từng loài ký sinh trùng, đặc biệt khi các dạng ký
sinh trùng cùng tồn tại ở một nơi như đường ruột ở hệ tiêu hóa, chất thải ở hệ
hô hấp hay máu của hệ tuần hoàn. Phương pháp sinh học phân tử nhân bản
DNA và phân tích đặc tính sản phẩm thu được, đặc biệt là phân tích biến đổi
gen/hệ gen được ứng dụng trong chẩn đoán phân loại và lập phả hệ sinh vật, đã
bước đầu chứng minh cho kết quả chính xác hơn nhiều so với phương pháp
truyền thống (Mori và Notomi, 2009). Các số liệu chính xác của các phương
pháp sinh học phân tử đã cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ
làm thay đổi một phần hệ thống phân loại và chẩn đoán phân biệt loài hiện có
(Littlewood, 2008).
Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới đã có những
định hướng phát triển vượt bậc. Một trong những thành tựu lớn của nhân loại là
sự phát triển phương pháp PCR (Polymerasa Chain Reaction) được ứng dụng
cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh
vật, trong đó có ký sinh trùng (Littlewood, 2008) và trở thành một công cụ
không thể thiếu được trong công tác giám định, phát hiện sinh vật (kể cả ký
sinh trùng) gây bệnh bằng kỹ thuật cao (Ishmael và Stellato, 2008). Do có tính
nhạy và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lượng rất ít khuôn DNA của
đối tượng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trưởng nào, PCR đã có thể cho sản
phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật cần nghiên cứu.
Từ thực tế trên, dưới sự giúp đỡ của Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng
Phân viện Thú y Miền Trung, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Định danh loài
Gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát
triển của ấu trùng Gnathostoma sp trong ký chủ trung gian”
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Xác định được tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lươn, ếch
tại Khánh Hòa.
Xác định thành phần loài Gnathostomasp phân lập được.
3
Nghiên cứu các giai đoạn phát triển ấu trùng Gnathostoma sp ở
Cyclopidae và ở cá lóc, lươn, ếch.
Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn
các hạn chế, em kính mong nhận được các ý kiến góp ý của quý thầy cô và
bạn bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân
thành cảm ơn!
4
CHƯƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm chung Gnathostoma sp
Gnathostoma thuộc bộ Spiruida, lớp Secernatea, ngành giun tròn
Nematoda, họ Gnathostomatidae, loài Gnathostoma Owen, 1936. Cho tới nay
Gnathostoma có 12 loài gây bệnh ở động vật, trong đó có 4 loài có thể gây
bệnh ở người đã được ghi nhận (Daengsvang, 1980).
1.1.1. Hình thái cấu tạo
Giun trưởng thành dài 11 – 54 mm và rộng 0,9 – 3,1 mm, đỉnh đầu của
giun có 8 hàng móc, thực quản dài 2,4mm, túi cổ nằm bên cạnh ở phần nửa trên
của thực quản, ruột màu đen; tinh hoàn hình ống uốn khúc (James Tseng,
2003). Ấu trùng L3 của giun Gnathostoma spinigerum dài từ 2,5 mm đến 5,1
mm, rộng từ 0,29 mm – 0,51 mm; cấu tạo đặc trưng của ấu trùng là đỉnh đầu có
4 hàng móc, số móc hàng 1 đến 4 lần lượt là 45, 48, 50 và 52 (Bong – Kwang
Jung và cộng sự, 2008). Trứng Gnathostoma có kích thước 38 – 40 µm x 65 –
70 µm và có nắp ở một đầu trứng (James Tseng, 2003).
Hình 1.1. Hình thái cấu tạo Gnathostoma sp
: www.med.cmu.ac.th )
Ghi chú: (1): trứng giun Gnathostoma; (2): giun đực trưởng thành;
(3): giun cái trưởng thành; (4): ấu trùng giun Gnathostoma; (5): phần đầu ấu
1
2
3
4 5 6
7
5
trùng giun Gnathostoma; (6): phần đầu giun Gnathostoma trưởng thành; (7):
đuôi của con cái trưởng thành
1.1.2. Vòng đời phát triển
Vòng đời Gnathostoma sp qua 3 vật chủ, bao gồm 2 vật chủ trung gian
và 1 vật chủ cuối cùng.
Giun trưởng thành sống trong khối U ở thành dạ dày của vật chủ cuối
cùng (chó, mèo, lợn, hổ, sư tử, báo, chồn), ở đây giun đẻ trứng, trứng theo phân
ra ngoài môi trường nước và phát triển phôi. Sau 10 – 15 ngày, trứng nở ra
giai đoạn ấu trùng kỳ 1 (L1).
Ấu trùng L1 bị ăn bởi vật chủ trung gian thứ nhất (giáp xác thuộc họ
Cyclopidae), ấu trùng di hành qua thành dạ dày, tới khoang cơ thể phát triển
thành ấu trùng kỳ 2 sau 7 – 12 ngày. Kích thước ấu trùng 0,49 – 0,52 mm.
Khi vật chủ trung gian thứ 2 (cá, ếch, rắn, lươn, ) ăn phải cyclop đã
nhiễm ấu trùng Gnathostoma, ấu trùng di hành qua thành dạ dày đến gan hoặc
cơ phát triển thành ấu trùng kỳ 3 hoàn thiện. Nếu vật chủ cuối cùng ăn phải vật
chủ trung gian thứ 2, ấu trùng phát triển đến giun trưởng thành khoảng 6 – 8


TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng việt
1. Hồ Quỳnh Thùy Dương (2003). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo
dục. Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Đề (2004). Sán lá gan. Nhà xuất bản y học, 2004, tr. 12 –
50.
3. Lê Thanh Hòa, D. P Mc Manus (2001b). Các hướng thiết yếu sử dụng
sinh học phân tử để giám định, phân loại các loài sinh vật. Tập san hội
nghị sinh học quốc tế, Hà Nội, 7 – 2001, trang: 107 – 108.
4. Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996). Ký sinh trùng thú y. Nhà xuất bản
Nông nghiệp hà Nội.
5. Lê Hữu Khương, Võ Hồng Cẩm Phương (2007), “Gnathostoma
spinigerum ký sinh trên chó của một số tỉnh phía nam”, Nghiên cứu Y
học, y học TP Hồ Chí Minh, tr. 74 – 79.
6. Phạm Sỹ Lăng, Lê Thanh Hải, Phạm Thị Rật (1993), “Một số nhận xét
về những loài giun tròn ký sinh ở thú ăn thịt ở vườn thú Thủ Lệ và chó
cảnh – kỹ thuật phòng trị”, Công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật
(1990 – 1991), Viện nghiên cứu thú y quốc gia, tr. 121 – 130.
7. Trần Xuân Mai (1992), Góp phần nghiên cứu bệnh động vật ký sinh một
chiều (ngõ cụt ký sinh) lây truyền từ phân chó mèo sang người, Luận án
phó tiến sĩ khoa học y dược trường Đai học Y Dược TP Hồ Chí Minh,
TP Hồ Chí Minh.
8. Lê Hữu Nghị, Nguyễn Văn Duệ (2000), “Tình hình nhiễm giun sán chó
nuôi tại Huế và hiệu quả thuốc tẩy”, Khoa học kỹ thuật thú y, 7(4), tr.
58–62.
9. Đặng Ngọc Thanh, Thái Trần Bảo, Phạm Văn Miên (1980): Định loại
động vật không xương sống nước ngọt Bắc Việt Nam. NXB KHKT –
Hà Nội, 318 – 400.
10. Ngô Huyền Thúy (1996), Giun sán đường tiêu hóa của chó ở Hà Nội và
một số đặc điểm của giun thực quản Spirocercalupi (Rudolphi, 1809),
luận án phó tiến sĩ nông nghiệp, Viện thú y Hà Nội.
49
11. Lê Thị Xuân, Phạm Thị Lệ Hoa, Nguyễn Quang Vinh, Trần Thị Huệ
Vân, Lê Xuân Tú, Trần Vinh Hiển (2003), “Bệnh nhiễm Gnathostoma ở
người tại TP Hồ Chí Minh”, Y học thực hành, 2003(447), tr. 117 – 119.
12. Lê Thị Xuân và cộng sự (2004): Hội nghị quốc tế về Gnathostoma –
Bangkok, Thái Lan. Y học nhiệt đới trong khu vực và mạng Y tế công
cộng, Bangkok, Thái Lan, 97 – 99.
II. Tài liệu nước ngoài
13. Almeyda – Artigas, R. J., V. A. Acosta – Hernandez, L. Alonzo – Diaz, M.
Castaneda – Sanchez and V. R. Zarate – Ramirez (1994). First record of
Gnathostoma procyonis Chandler, 1942 in Mexico, and a note on larva
G.binucleatum Almeyda – Artgas, 1991 (Nematoda: Spirurida). Research
and Reviews in Parasitology 54: 93 – 98.
14. Anantaphruti. M.T, 2010: Esophageal deformation of Gnathostoma
spinigerum in ivermectin – treated rats, and anthelminthic efficacy,
biomedical and life sciences, helminthologia. 2, 88 – 93.
15. Beaver PC, Jung RC, Cupp EW. Clinical parasitology. 9th ed.
Philadelphia: Lea & Febiger, 1984.
16. Bhaibulaya M. 1985. Effect of gamma ray on the metacercarie of liver
fluke (Opisthorchis viverrini) infective stages of parasite caused by
consumption of raw or semiprocessed fish. Fd Irradiat Newsl 9(2):8.
17. Bong – Kwang Jung và cộng sự, (2008)Detection of Gnathostoma
spinigerum Third – Stage Larvae in Snakeheads Purchased from a
Central Part of Myanmar. Korean J Parasitol. 2008 December; 46(4):
285–288.
18. Chellappa. D.J, Anantaraman. M (1970): The development of
Gnathostomaspinigerum Owen, 1936, in its first intermediate host,
Mesocyclops Leuckarticlaus, 1857, in india with remarks on its zoonosic
importance. Veterinary Dispensary, Pennadam, S.Arcot. No 9, May.
19. Chris Thomas (1996). PCR technique. Edited by G. D. Foster and D.
Twell: 331 – 361.
50
20. Daengsvang S (1972): An experimental study on the life cycle of
Gnathostoma hispidum Fedchenko 1872 in Thailand with special
reference to the incidence and some significant morphological
characters of the adult and larva stages. Southeast Asian JTrop Med
Public Health, 3: 376 – 389.
21. Daengsvang S (1980) A monograph on the genus Gnathostoma and
gnathostomasis in Thailand. Southeast Asian Medical Information
Center (SEAMIC) & International Medical Foundation of Janpan, p 1 –
85.
22. Daengsvang S (1981) Gnathostomiasis in Southeast Asia. Southeast
Asian J. Trop. Med. Public Health 12: 319 – 332.
23. Florencia Bertoni – Ruiz, Luis García – Prieto, David Osorio –
Sarabia, Virginia León – Règagnon (2005). A new species of
Gnathostoma (Nematoda: Gnathostomatidae) in Procyon lotor
hernandezii from Mexico.The Journal of parasitology. 11/2005;
91(5):1143 – 1149.
24. James Tseng, 2003Gnathostoma spinigerum(On – line), Animal
Diversity Web Accessed May 29, 2012 tại at
http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Gnath
ostoma_spinigerum.html
25. Jimenez, pedro j and alava, juan josé, 2009: Gnathostoma (Spirurida:
Gnathostomatidae) infection in the tigerfish Hoplias microlepis:
prevalence, correlation with fish size, hosts, and public health
implications. Biomédica [online]. 4, 591 – 603.
26. Koga M, Ishibashi J, Ishii Y, Hasegawa H, Choi DW, Lo TY (1985):
morphology and Experimental infections of Gathostomse larvae from
imported loaches. Misgurnusanguilicaudatus. Jpn J Parasitol 34: 361 –
370 (in Japanese).
27. Le Thi Xuan, Rojekittikhun W (2000). A survey of infective larvae
of Gnathostoma in eels sold in Ho Chi Minh city. Southeast Asian J
Trop Med Public Health 2000;31:133 – 137.
51
28. Le VH, Nguyen VA, Ta VL (1965): Gnathostoma and gnathosthomose
humaine au Vietnam. Bull Soc Path Exot, 58, 236.
29. Littlewood DT (2008) Platyhelminth systematics and the emergence of
new characters. Parasite 15(3): 333 – 341.
30. Maleewong, Pariyanonda, Sitthithaworn, 1992: Seasonal variation in the
prevalence and intensity of canine Gnathostoma spinigerum infection in
northeastern Thailand. Journal of Helminthology. 66, 72 – 74.
31. McCarthya J, Moore TA (2000) Emerging helminth zoonoses. Intl J
Parasitol 30: 1351-1360.
32. Miyazaki I (1952): On the second stage larvae of three species of
Gnathostoma occurring in Japan (Nematoda: Gnathostomidae). Acta
Med 22:1433 – 1441 (in Japanese).
33. Miyazaki I (1960): On the genus Gnathostoma and human
gnathostomiasis, with special reference to Japan. ExpParasitol, 9:338 –
370.
34. Miyazaki I (1991): An illustrated book of helminthic zoonoses.
International Medical Foundation of Japan. Tokyo, Japan. P 368 – 409.
35. Niti – Uthai S. Studies on Gnathostoma spinigerum: I. Development of
eggs, and larvaeincyclops. II. Experimental and naturalinfections in
brackish water fishes [M.Sc.thesis]. Bangkok: Mahidol Univ.; 1974.
36. Ogata K, Imai J, Nawa Y. Three confirmed and five suspected human
cases of Gnathostoma doloresi infection found in Miyazaki Prefecture,
Kyushu. Jpn J Parasitol 1998;37:358 – 64.
37. Penchom Janwan, Pewpan M Intapan, Oranuch Sanpool, Luxkhana
Sadaow, Tongjit Thanchomnang and Wanchai Maleewong (2001):
Growth and development of Gnathostoma spinigerum (Nematoda:
Gnathostomatidae) larvae in Mesocyclops aspericornis (Cyclopoida:
Cyclopidae), Parasites & Vectors, BioMed Centeral, 4:93.
38. Roberto J. Almeyda – Artigas, M. Dolores Bargues, Santiago Mas –
Coma (2000): its – 2 RDNa sequencing of Gnathostoma species