Luận Văn Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus và tomato spotted

MỤC LỤC


CHưƠNG TRANG


Lời cảm tạ . .i


Tóm tắt ii


Tóm tắt bằng tiếng Anh iii


Mục lục . .iv


Danh sách các chữ viết tắt viii


Danh sách các bảng, biểu đồ ix


Danh sách các hình .x


PHẦN I. MỞ ĐẦU 1


1.1. Đặt vấn đề 1


1.2. Mục đích yêu cầu .2


1.2.1. Mục đích .2


1.2.2. Yêu cầu .2


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3


2.1. Cà chua .3


2.1.1. Sơ lược về cà chua .3


2.1.2. Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới 3


2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt 4


2.2. Bệnh hại trên cà chua .4


2.2.1. Sơ lược về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) .6


2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra .6


2.2.1.2 Phân loại của TSWV 7


2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế 7


2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV 8


2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV . 8


2.2.1.6 Tính chất của TSWV 9


2.2.1.7 Vector truyền 9

2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV 10


2.2.1.9 Triệu chứng bệnh 11


2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV . 11


Cây kháng 11


Quản lý TSWV . 12


2.2.2. Sơ lược về Tobacco Mosaic Virus (TMV) . 14


2.2.2.1 Lịch sử của bệnh . 14


2.2.2.2 Phân loại của TMV . 14


2.2.2.3 Sự phân bố của TMV 14


2.2.2.4 Ký chủ của TMV 14


2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của TMV 14


2.2.2.6 Tính chất của TMV . 16


2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh 17


2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV . 17


2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV . 17


2.2.2.10 Phòng trừ 19


2.2.3. Sơ lược về Cucumber Mosaic Virus (CMV) . 19


2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV 19


2.2.3.2 Phân loại CMV .20


2.2.3.3 Phạm vi phân bố .21


2.2.3.4 Ký chủ .21


2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV 21


2.2.3.6 Tính chất lý hóa của CMV .23


2.2.3.7 Sự truyền bệnh 24


2.2.3.8 Điều kiện phát triển của bệnh .24


2.2.3.9 Triệu chứng 25


2.2.3.10 Phòng trừ .25


2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật 26


2.3.1. Phương pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị 26


2.3.2. Phương pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu .26


2.3.3. Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng học 26


2.3.4. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh .27


2.3.4.1 Phương pháp Direct ELISA 28


2.3.4.2 Phương pháp Indirect ELISA 28


2.3.4.3 Phương pháp Sanwich ELISA. .28


Direct Sanwich ELISA hay DAS-ELISA


(Double antibody sandwich-ELISA) 28


Indirect Sanwich ELISA 28


2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA) .28


2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor 28


2.3.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào trình tự đoạn DNA. .29


2.3.5.1 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length


Polymorphirm) 29


2.3.5.2 Phương pháp PCR hay RT-PCR đối với RNA .29


2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác .29


2.3.5.4 Phương pháp sử dụng probe đánh dấu .29


2.3.5.5 Array .29


2.4. Phương pháp DAS-ELISA và phương pháp RT-PCR .30


2.4.1. Phương pháp DAS-ELISA .30


2.4.2. Phương pháp RT-PCR .30


2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh do CMV,


TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây 32


2.5.1. Ở nước ngoài 32


2.5.2. Ở Việt Nam 33


PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .34


3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .34


3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài 34


3.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài .34.

3.2. Vật liệu .34


3.2.1. Dụng cụ 34


3.2.2. Hóa chất 34


3.3. Phương pháp .35


3.3.1. Điều tra và lấy mẫu .35


3.3.2. Phương pháp nghiên cứu 35


3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS-ELISA .35


3.3.2.2 Chẩn đoán bằng RT-PCR .36


Ly trích RNA .36


Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA 37


Phản ứng PCR 38


3.3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR .44


PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46


4.1. Phản ứng ELISA .46


4.1.1. Kết quả ELISA .46


4.1.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với


các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV 47


4.1.3. Tỷ lệ bệnh theo tuổi cây thể hiện trong số mẫu điều tra 48


4.1.4. Tỷ lệ bệnh theo địa điểm thể hiện trong số mẫu điều tra .49


4.1.5. Tỷ lệ bệnh theo giống cà thể hiện trong số mẫu điều tra 51


4.1.6. Triệu chứng thực tế trong các mẫu thí nghiệm 52


4.1.7. Tỷ lệ bệnh theo loại triệu chứng quan sát được . 53


4.2. Kết quả của phản ứng RT-PCR 57


Kết quả RT-PCR sử dụng cặp primer 1 . 57

1 2

Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3 .62


PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .70


5.1. Kết luận 70


5.2. Đề nghị .71


PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 73


PHỤ LỤC 1 Thành phần các dung dịch trong phản ứng ELISA .76


PHỤ LỤC 2 Thành phần các chất trong kit tổng hợp iScriptTM. .77


PHỤ LỤC 3 Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR .78


PHỤ LỤC 4 Hình chụp các đĩa chứa mẫu phân tích bằng ELISA 79


PHỤ LỤC 5 Bảng câu hỏi điều tra . 80


PHỤ LỤC 6 Danh sách các trình tự tương đồng với TMV dòng ở Trung Quốc


dùng để thiết kế primer 81


ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BưỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR