Thạc Sĩ Đánh giá mức độ ô nhiễm kháng sinh nhóm Tetracycline trong thịt bò thăn, tôm rảo và sữa bột trên thị

Luận văn thạc sĩ năm 2012
Đề tài: Đánh giá mức độ ô nhiễm kháng sinh nhóm Tetracycline trong thịt bò thăn, tôm rảo và sữa bột trên thị trường Hà Nội và những nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

MỤC LỤC
PHẦN I : MỞ ðẦU 1
1.1. ðẶT VẤN ðỀ 1
1.2. MỤC ðÍCH VÀ YÊU CẦU 2
1.2.1. Mục ñích: 2
PHẦN II: TỔNG QUAN 3
2.1. GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLINE 3
2.2. PHÂN LOẠI 3
2.3. MỘT SỐ ðẶC DIỂM CỦA CÁC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLINE .4
2.3.1. Cơ chế tác dụng .4
2.3.2. Phổ tác dụng 5
2.3.3. Sự hấp thu, phân bố và thải trừ .5
2.3.4. Tính kháng thuốc .6
2.3.5. Ứng dụng .7
2.3.6. Tác dụng phụ của Tetracycline .7
2.3.7 Tác hại của kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi 8
2.4. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM .9
2.4.1 Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới . 9
2.5. CÁC YẾU TỐ DẪN TỚI TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG THỰC PHẨM
VÀ TÁC HẠI CỦA NÓ 13
2.5.1. Khái niệm về tồn dư kháng sinh .13
2.5.2. Các yếu tố dẫn tới tồn dư kháng sinh trong thực phẩm 13
2.5.3. Tác hại của việc tồn dư kháng sinh .14
2.6. QUY ðỊNH VỀ TỒN DƯ KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLINE
TRONG THỰC PHẨM CỦA QUỐC TẾ VÀ VIỆT NAM .16
Thực phẩm .17
2.7. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ðỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH
NHÓM TETRACYCLINE TRONG CÁC SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC
ðỘNG VẬT 18
2.7.1. Phương pháp vi sinh vật 18
2.7.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) .18
2.7.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) .19
2.7.4. Phương pháp ñiện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) 19
2.7.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography - HPLC) .19
PHẦN 3: VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .29
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.3.1. Lấy mẫu phân tích .29
3.3.2. Phương pháp phân tích 29
3.3.3. Thiết bị và dụng cụ .29
3.3.4. Hóa chất và thuốc thử .30
3.3.5 Quy trình phân tích .32
3.3.6 ðiều kiện sắc ký .33
3.3.7. Tính toán kêt quả .33
3.4. TỔNG HỢP QUY TRÌNH PHÂN TÍCH KHÁNG SINH NHÓM T ETRACYCLINE 34
3.4.1. Quy trình phân tích kháng sinh nhóm Tetracyline trong thịt bò thăn và tôm rảo 34
A - Xử lý mẫu: .34
3.4.2. Quy trình phân tích kháng sinh nhóm Tetracyline trong sữa bột .36
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
4.1. THẨM ðỊNH PHƯƠNG PHÁP 37
4.1.1. Giới hạn phát hiện LOD 37
4.1.2. Giới hạn ñịnh lượng LOQ .39
4.1.3. Xây dựng ñường chuẩn .40
4.1.4 Xác ñịnh hệ số thu hồi (R%) 43
4.1.5. Xác ñịnh ñộ lệch chuẩn tương ñối (RSD% hay hệ số biến thiên CV%) 44
4.2. Xác ñịnh dư lượng kháng sinh nhóm Tetracyclinetrong thịt bò thăn, tôm rảo
và sữa bột .45
4.4 Kiến nghị .54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .55
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Công thức cấu tạo của các chất kháng sinh nhóm Tetracycline 4
Bảng 2. Dư lượng tối ña kháng sinh nhóm Tetracycline trong thực phẩm 17
Bảng 3: Các loại ñầu dò thường dùng . 22
Bảng 4: Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn ñịnh lượng (LOQ) của các
kháng sinh nhóm Tetracycline 40
Bảng 5: Diện tích các Píc của OTC tương ứng với từng nồng ñộ chuẩn . 40
Bảng 6: Diện tích các Píc của TC tương ứng với từngnồng ñộ chuẩn 41
Bảng 7: Diện tích các Píc của CTC tương ứng với từng nồng ñộ chuẩn 42
Bảng 8: Tổng hợp các giá trị LOD, LOQ, r
2
của phương pháp ñối với nhóm
kháng sinh Tetracycline 42
Bảng 9: Hệ số thu hồi (R%) của các kháng sinh nhóm Tetracycline ñối với
các mẫu thịt bò thăn và tôm rảo 44
Bảng 10: ðộ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên CV (%) của các kháng sinh
nhóm Tetracycline ñối với các mẫu thịt bò thăn và tôm rảo 45
Bảng 11. Kết quả xác ñịnh OTC, TC, CTC mẫu chợ Thành Công . 46
Bảng 12. Kết quả xác ñịnh OTC, TC, CTC mẫu chợ HàoNam 47
Bảng 13. Kết quả xác ñịnh OTC, TC, CTC trong mẫu chợ Hôm . 48
Bảng 14. Kết quả xác ñịnh OTC, TC, CTC trong mẫu chợ Hàng Bè 49
Bảng 15. Kết quả phân tích kháng sinh nhóm TC trongsữa bột 50
Bảng 16 . Tỷ lệ & mức dư lượng Oxytetraxyclin (OTC)có trong 3 loại thực
phẩm nghiên cứu: 52
Bảng 17 . Tỷ lệ & mức dư lượng Tetraxyclin (TC) có trong 3 loại thực phẩm
nghiên cứu: 52
Bảng 18 . Tỷ lệ & mức dư lượng Chlotetraxyclin (CTC) có trong 3 loại thực
phẩm nghiên cứu: 52
Bảng 19. Giới hạn tối ña ăn vào chấp nhận ñược ñối với trẻ 53

PHẦN I : MỞ ðẦU
1.1. ðẶT VẤN ðỀ
Ngay từ khi ñược phát hiện và chiết xuất thành côngñến nay, ở Việt Nam
cũng như nhiều nước khác trên Thế giới, kháng sinh ñã và ñang ñóng một vai trò
quan trọng trong phòng chống dịch bệnh cho con người và vật nuôi. Ngoài hiệu
quả phòng trị, kháng sinh trộn vào thức ăn ở liều thấp còn có tác dụng kích thích
sinh trưởng, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn qua ñó góp phần nâng cao hiệu
quả kinh tế chăn nuôi (Phạm Kim ðăng và cs, 2010a).Tuy nhiên, việc quá lạm
dụng hoặc sử dụng sai nguyên tắc trong chăn nuôi sẽgây nên một mối nguy tiềm
tàng ñối với sức khỏe cộng ñồng.
Tetracycline là một trong những nhóm kháng sinh ñược sử dụng rộng rãi
và có hiệu quả trong ñiều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn gram dương và
gram âm gây nên. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinhnói chung và Tetracycline
nói riêng trong chăn nuôi không ñúng liều lượng và liệu trình, ñặc biệt sử dụng
liều thấp thường xuyên, ngoài việc có thể làm xuất hiện các chủng vi sinh vật
kháng thuốc còn gây nên sự tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi.
Người tiêu dùng sử dụng các sản phẩm tồn dư kháng sinh nhóm Tetracycline có
thể gây một số tác hại như rối loạn tiêu hóa, thai nhi kém phát triển hoặc gây
hiện tượng quá mẫn hoặc các bệnh làm biến ñổi màu răng ở trẻ em.
Ở Việt Nam, do sử dụng nhiều loại kháng sinh như penicillin,
streptomycin, sulfonamide, tetracycline và kéo dài trong chăn nuôi ñể ñiều trị
bệnh cho gia súc nên không tránh khỏi còn tồn dư một lượng dư kháng sinh ở thực
phẩm. Nhằm tăng khả năng chống chịu những thay ñổi của môi trường và mầm
bệnh nên trong quá trình chăn nuôi, người ta thườngsử dụng kháng sinh trộn vào
thức ăn, vào nước uống hoặc tiêm với mục ñích kích thích tăng trưởng, phòng
bệnh và trị bệnh. Tuy vậy, nếu loại bỏ hoàn toàn kháng sinh trong ñiều trị, trong
thức ăn sẽ làm tăng chi phí cho nhà sản xuất, sản l ượng gia súc, gia cầm hàng năm
không ñáp ứng ñược nhu cầu trong nước và xuất khẩu.Vấn ñề ñặt ra là các cơ
quan quản lý liên Bộ-ngành về chất lượng vệ sinh antoàn thực phẩm, chất lượng
thuốc thú y trong ñó có kháng sinh sử dụng trong th ức ăn chăn nuôi thế nào cho
ñúng và an toàn cho mọi người. ðể bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, Tổ chức y tế
Thế giới (WHO), Tổ chức Nông Lương (FAO), các nước phát triển khác, Việt
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp .
2
Nam ñã thiết lập các tiêu chuẩn về hàm lượng tồn dưkháng sinh tối ña trong thực
phẩm (Phạm Kim ðăng, 2009). Giới hạn các chất này ñược áp dụng cho cả các
kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng có trong thực phẩm.
Ở nước ta, năm 2007, Bộ Y Tế ñã ban hành Quyết ñịnhsố 46/2007/Qð-BYT quy ñịnh giới hạn tối ña ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm,
trong ñó có giới hạn tối ña dư lượng kháng sinh nhóm Tetracycline. Cùng với
sự tăng cường quản lý nhà nước về chất lượng thực phẩm, các cơ sở sản xuất,
chăn nuôi, chế biến thực phẩm cũng rất cố gắng nângcao chất lượng sản phẩm
tạo thương hiệu và niềm tin ñối với người tiêu dùngnên việc phân tích phát
hiện và ñịnh lượng tồn dư nói chung và dư lượng kháng sinh trong thực phẩm
nói riêng ở nước ta ñang trở nên cấp thiết.
Một số nghiên cứu ñã ñề cập ñến những tác dụng ngoài ý muốn của
kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi chế biến sẵn ñếnchất lượng vệ sinh an
toàn thực phẩm. Người tiêu dùng ngày nay ñã cảnh giác với những thực phẩm
có liên quan ñến công nghệ sinh học, các loại phụ gia thực phẩm và việc lạm
dụng kháng sinh trong ñiều trị bệnh tật cho người và gia súc, gia cầm.
Việc lạm dụng các chất kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gần
ñây ñã ñược cảnh báo. Do vậy, ñể cung cấp số liệu có tính khoa học tôi ñã lựa
chọn nghiên cứu ñề tài: “ðánh giá mức ñộ ô nhiễm kháng sinh nhóm
Tetracycline trong thịt bò thăn, tôm rảo và sữa bộttrên thị trường Hà Nội
và những nguy cơ ảnh hưởng ñến sức khỏe cộng ñồng”.
Hy vọng kết quả của ñề tài sẽ góp phần ñề xuất biệnpháp tăng cường
công tác quản lý việc sản xuất và sử dụng các chất kháng sinh một cách có hiệu
quả trong thực phẩm nhằm thúc ñẩy sự phát triển ngành chăn nuôi, cung cấp ñủ
nguồn thực phẩm sạch, vệ sinh an toàn, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
1.2. MỤC ðÍCH VÀ YÊU CẦU
1.2.1. Mục ñích:

ðánh giá mức ñộ tồn dư kháng sinh Tetracycline trong các mẫu thịt
bò thăn, tôm rảo và sữa bột tại các chợ trọng ñiểm ở Hà Nội.

ðánh giá những nguy cơ ảnh hưởng ñến sức khỏe cộng ñồng.

1.2.2. Yêu cầu:

Xác ñịnh lượng tồn dư kháng sinh Tetracycline trongcác mẫu thịt
bò thăn, tôm rảo và sữa bột tại các chợ trọng ñiểm ở Hà Nội.

ðánh giá mức ñộ ô nhiễm ñó theo tiêu chuẩn quốc tế WHO/FAO.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp .
3
PHẦN II: TỔNG QUAN
2.1. GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLINE
Tetracycline là kháng sinh phổ rộng ñược sử dụng rộng rãi trong thú y
ñể ñiều trị các bệnh nhiễm khuẩn của gia súc, gia cầm.
Việc phát minh ra kháng sinh và các ñặc tính của chúng ñã tạo ra một
cuộc cách mạng trong y học và cứu loài người thoát khỏi nhiều thảm dịch do
vi trùng gây ra. Việc sử dụng kháng sinh trong thứcăn chăn nuôi ñược ñánh
dấu bằng một thí nghiệm của Stokstad và Juke (1949)khi cho gia cầm ăn thức
ăn có bổ sung Aureomycin thấy rằng tốc ñộ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng
thức ăn của gia cầm tăng rõ rệt. Từ ñó rất nhiều công trình nghiên cứu về
kháng sinh như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôiñược thực hiện và bắt
ñầu từ những năm 1950 và 1960 của thế kỷ 20, một kỷnguyên mới của ngành
chăn nuôi ñã ñược mở ra khi kháng sinh ñược coi nhưmột yếu tố không thể
thiếu và ñã tạo nên một bước ñột phá về năng suất và hiệu quả chăn nuôi ở
nhiều nước trên thế giới.
Ba loại kháng sinh nhóm Tetracycline quan trọng và ñược dùng phổ
biến hiện nay ở nước ta là tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline.
2.2. PHÂN LOẠI
 Kháng sinh nhóm Tetracyclin bao gồm 3 loại chính Oxytetracycline,
Tetracycline và Chlortetracycline:

Oxytetracycline:là một kháng sinh phổ rộng ñược sử dụng phổ biến
trong thuốc thú y ñể hạn chế sự tổng hợp protein trong vi khuẩn Gram dương
và vi khuẩn Gram âm. Những người dân Châu Âu ñã sử dụng rộng rãi OTC
trong chăn nuôi các loài ñộng vật như: gia súc, cừu, dê và lợn. Phần lớn lượng
OTC ñược dự trữ sẵn ñể có thể chăm sóc sức khỏe vậtnuôi bằng cách trộn lẫn
vào thức ăn hoặc tiêm hoặc cho uống sau khi nghiên và hòa tan trong nước
(Smyrniotakis and Helen, 2006).

Tetracycline:là kháng sinh phổ rộng ñược sử dụng rộng rãi trong
thú y ñể ñiều trị các bệnh nhiễm khuẩn của gia súc,gia cầm (Từ Minh Koóng,
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp .
4
2004).

Chlortetracycline:là một kháng sinh phổ rộng chống lại cả hai loại
vi khuẩn Gram âm và Gram dương gồm cả Mycoplasma, Chlamydia, trùng rận.
Nó ñược kích hoạt trong việc kiểm soát và ñiều trị bệnh lỵ, thương hàn của gà
và viêm ñường ruột của heo gây ra bởi vi khuẩn tả và vi trùng phó thương hàn
trong gia cầm và gia súc (Nguyễn Quốc Ân, 2009).
 Công thức cấu tạo:
Hình 1: Công thức cấu tạo của các kháng sinh nhómTetracycline
(Nguồn: Từ Minh Koóng, 2004)
Bảng 1: Công thức cấu tạo của các chất kháng sinh nhóm Tetracycline
Tên R2R5R6aR6R7
Oxytetracycline H OH OH CH3
H
Tetracycline H H OH CH3
H
Chlortetracycline H H OH CH3
Cl
2.3. MỘT SỐ ðẶC DIỂM CỦA CÁC KHÁNG SINH NHÓM TETRA CYCLINE
2.3.1. Cơ chế tác dụng
Các Tetracycline ñược vận chuyển theo phương thức tích cực qua màng
bào tương của các vi khuẩn mẫn cảm với thuốc. Các yếu tố vận chuyển tích cực
này chỉ có ở vi khuẩn mà không có ở tế bào cơ thể vật chủ. Sau khi thuốc vượt
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp .
5
qua màng bào tương, sẽ gắn vào tiểu phần 30s của Ribosom và ñồng thời cũng
gắn cả vào ARN thông tin, từ ñó ngăn cản sự gắn kếtcác axít amin vào chuỗi
Peptid qua ñó ức chế quá trình tổng hợp Protein củavi khuẩn. Kháng sinh
nhóm Tetracycline ñều có tác dụng kìm khuẩn. Cả ở khu vực nội dịch và ngoại
dịch tế bào, ñều có tác dụng như nhau.
2.3.2. Phổ tác dụng
Kháng sinh nhóm Tetracycline có phổ tác dụng rất rộng. Chúng tác dụng
với rất nhiều loại vi khuẩn Gram dương và âm, nhiềuloại Mycoplasma,
Clamidia, Richketsia; tác dụng cả với các Protozoa(ở nồng ñộ cao) như
Theileria, Anaplasma, Eperythrozoom.Tác dụng tốt với các Clostridium,
Listeria, Streptococcus, E.rhusiopathiae, Brucella,B,bronchiseptica,
Klebsiella. Không tác dụng với P.aeruginosa, P. vulgaris (Phạm Khắc Hiếu,
2009).
2.3.3. Sự hấp thu, phân bố và thải trừ
 Hấp thu
Tetracycline thường ñược hấp thu theo ñường uống, có thể tiêm tĩnh
mạch, tiêm bắp cho ñộng vật, tiêm dưới da cho gia cầm. Nếu ñưa thuốc bằng
ñường miệng, kháng sinh nhóm Tetracycline có thể giữ ñược nồng ñộ tác dụng
trong máu từ 2 - 4 h. OTC ñược thải qua phân với nồng ñộ 2,5 mg/g phân khi
cho uống ở người. Khả năng hấp thu của thuốc sẽ giảm ñi nhiều nếu cho uống
cùng với sữa, các sản phẩm của sữa và các muối của các ion Al
+++
, Mn
++
, Mg
++
,
Ca
++
Nếu tiêm thuốc ñược hấp thu gần như hoàn toàn, nhanh ñạt nồng ñộ hữu
hiệu trong máu hơn ñường uống. Tiêm thuốc cũng ñượcphân bố trong dịch tổ
chức ñều hơn, rộng hơn so với uống. Do vậy hiệu quảñiều trị cũng cao hơn.
Sau khi uống khoảng 2 - 4 h thuốc ñạt nồng ñộ hữu hiệu trong máu và
ñược giữ trong khoảng 6 h hay lâu hơn, ñôi khi có thể kéo dài tới 24 h hay 30h.
Nếu cứ sau 6 h lại uống 250 mg nồng ñộ thuốc trong máu ñạt 1 - 3 µg/ml. Còn
uống liều 500 mg, nồng ñộ thuốc trong máu ñạt 3 - 5µg/ml. Liều 1 g nồng ñộ
cao hơn 5 µg/ml. Nồng ñộ này duy trì trong suốt thời gian ñiều trị.
Khi tiêm liều 250 - 500 mg, nồng ñộ thuốc trong máuñạt từ 5 - 10 µg/ml

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tôn Thất Sơn (2006), “Dinh dưỡng và thức ăn vật nuôi”, NXB Hà Nội.
2. Nguyễn Quốc Ân (2009), “Sử dụng kháng sinh trongchăn nuôi thú y ở
Việt Nam”, Cục Thú Y.
3. Bùi Thị Tho (2006), Giáo trình dược lý học thú y.
4. Xuân Hùng (2003), Nỗi lo dư lượng thuôc kháng si nh trong thực phẩm. ðịa chỉ:
http://www.tcvn.gov.vn/web_pub_pri/managine/index.p hp?p=show_page&cid=&parent
=83&sid=96&iid=1829 .
5. ðào Hữu Vinh (1985). Các phương pháp sắc ký. Nhàxuất bản khoa học kỹ
thuật.
6. Nguyễn ðức Lưu, Nguyễn Hữu Vũ (2003). Thuốc thú y và cách sử dụng,
Nhà xuất bản Nông nghiệp.
7. Từ Minh Koóng (2004). “Kỹ thuật sản xuất dược phẩm,tập 2”. Bộ Y tế
8. Nguyễn Văn Cách (2004). Công nghệ lên men các chất kháng sinh. Nhà
xuất bản khoa học và kỹ thuật.
9. Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng cao áp (Tài liệu
giảng dạy cho sinh viên khoa hóa), ðại học quốc giaHà Nội.
10. Phạm Khắc Hiếu (2009), Giáo trình dược lý học thú y, Nhà xuất bản giáo
dục Việt Nam.
11. Trần Quốc Việt (2007), Sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và
vấn ñề vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện Chăn Nuôi. ðịa chỉ:
http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=2754.
12. ðinh Thiện Thuật, Nguyễn Ngọc Tuân, Võ Thị Trà An,Lê Thanh Hiển, Võ
Bá Lâm, Khương Thị Ninh (2003): “Bước ñầu khảo sát tình hình sử dụng kháng
sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt và thịt thương phẩm trên
ñịa bàn tỉnh Bình Dương”. Tạp chí KHKT Thú y, Số 1 (Tập X(1)), tr.50-57.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp .
56
13. ðào Tố Quyên, Lê Hồng Dũng, Phạm Thanh Yến, Trần Thắng, Bùi Thị
Ngoan và cộng sự khoa thực phẩm Viện Dinh dưỡng. “ Một số chỉ tiêu an
toàn vệ sinh của thịt lợn tại thị trường Hà Nội năm2005 ”. Kỷ yếu hội nghị
khoa học VSATTP lần thứ 4-2007. Nhà xuất bản Y học - Hà Nội 2007.
(Trang 257-64).
14. C.G.Smyrniotakis, Helen A. Archontaki (2006). “C18
columns for the
simultaneous determination of oxytetracycline and its related subsatances by
reversed-phase high performance liquid chromatography and UV detection”.
Journal of Pharmaceutical and biomedial analysis.
15. Ghislain Follet (2000), Antibiotic resistance in the EU – Science, Politics and
Policy, AgbioForum – Volume 3. Number 3&3. 2000. 148-155 pages. ðịa chỉ:
http://www.agbioforum.org/v3n23a13-follet.htm.