Thạc Sĩ Đánh giá một số dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống L18, L23, MD7 v

1. Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao. Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích
25,6 triệu ha [13].

Hạt lạc là một trong những nguồn thực phẩm chứa nhiều chất béo và protein cần thiết cho khẩu phần ăn của con người. Ngoài ra, hạt lạc còn chứa nhiều vitamin và một lượng hydratcacbon nhất định. Hạt lạc là nguyên liệu chính để sản xuất dầu ăn, bánh kẹo, fomat, . và là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Các phụ phẩm của lạc (khô dầu, thân, lá) được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hay phân bón đều rẻ tiền. Trồng lạc có tác dụng chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông nghiệp hiện nay [12], [13].
Ở Việt Nam, cây lạc đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp, đặc biệt ở những nơi khí hậu thường xuyên biến động và điều kiện canh tác còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, việc tổng kết kinh nghiệm thực tiễn và áp dụng khoa học tiên tiến vào sản xuất đã góp phần tăng năng suất một cách đáng kể [20]. Tuy nhiên, do điều kiện khí hậu của Việt Nam nắng nóng, mưa nhiều nên sản xuất lạc ở nước ta vẫn còn nhiều yếu tố hạn chế, một trong những nhân tố chính có ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng lạc là khô hạn. Để hạn chế ảnh hưởng của năng suất cây trồng nói chung, cây lạc nói riêng, ngoài các biện pháp tưới tiêu hợp lý cần sử dụng các giống có năng suất và khả năng chịu hạn cao, đặc biệt ở những vùng đất không chủ động nước. Vì vậy, nghiên cứu các đặc điểm nông học, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn của các giống lạc là rất cần thiết.
Một trong những hướng nghiên cứu đang được quan tâm hiện nay là sử dụng các chỉ thị phân tử và công nghệ tế bào thực vật để cải tiến đặc điểm năng suất, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn của một số giống cây trồng, trong đó có cây lạc. Bằng kĩ thuật nuôi cấy invitro, chúng tôi đã tạo được một số dòng cây từ mô sẹo chịu mất nước của các giống lạc L18, L23, MD7 và MD9. Trên cơ sở nghiên cứu chọn dòng chịu hạn của các giống và các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô
sẹo chịu mất nước ở quần thể R0 và thế hệ R1 [49] và với mục đích chọn tạo được các dòng lạc có các đặc điểm nông học mong muốn, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn cao, chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Đánh giá một số dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống L18, L23, MD7 và MD9”

2. Mục tiêu nghiên cứu

Thông qua việc đánh giá các đặc điểm nông học, sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử nhằm chọn dòng có năng suất, chất lượng và khả năng chịu hạn cao tại Thái Nguyên từ một số dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống lạc L18, L23, MD7 và MD9.
3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Phân tích một số đặc điểm nông học của các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống L18, L23, MD7, MD9 ở thế hệ R2, R3.
3.2. Đánh giá chất lượng hạt các dòng chọn lọc thông qua phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh: protein, đường, lipit và thành phần amino acid trong hạt tiềm sinh ở thế hệ R3.
3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thế hệ R4 ở giai đoạn nảy mầm và

cây non.

3.4. Phân tích sự thay đổi ADN genome của một số dòng chọn lọc thế hệ R4 bằng kĩ thuật RAPD.


MỤC LỤC

Trang

Mở đầu . 1

Chương 1. Tổng quan tài liệu 3

1.1. Giới thiệu về cây lạc . 3

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, phân bố và đặc điểm sinh học cây lạc 3

1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lạc 4

1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam . 5

1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật . 7

1.2.1. Khái niệm về hạn và ảnh hưởng của hạn tới thực vật 7

1.2.2. Tác động của hạn đối với cây lạc 8

1.2.3. Cơ sơ sinh ly, sinh hoa va di truyên cua tinh chiu han ơ cây lạc . 9

1.2.3.1 Cơ sở sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn 9

1.2.3.2 Cơ sở phân tử của tính chịu hạn 10

1.2.4 Ứng dụng của công nghệ tế bào thực vật trong đánh giá và chọn dòng

chịu hạn ở lạc. 12

1.3. Kĩ thuật RAPD trong phân tích hệ gen thực vật 13

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vât liêu . 18

2.1.1. Vật liệu thực vật 18
2.1.2. Hóa chất và thiết bị . 18

2.2. Phương phap nghiên cưu 19

2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm nông học các dòng chọn lọc . 19

2.2.2. Phương pháp đánh giá chất lượng hạt . 20

2.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn . 22

2.2.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm . 22

2.2.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá băng phương phap

gây han nhân tao 24

2.2.4. 2.2.4. Phương pháp đánh giá sự thay đổi ADN genome 25

2.2.5. Xử lý số liệu và tính toán kết quả . . 27

Chương 3. Kết quả và thảo luận

3.1. Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc 29
3.1.1. Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R2 29

3.1.2. Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R3 37

3.1.3. Nhận xét về đặc điểm nông học và kết quả chọn lọc ngoài đồng ruộng . 41

3.2. Chất lượng hạt của một số dòng lạc chọn lọc thế hệ R3 43

3.2.1. Hàm lượng lipit, protein và đường tan trong hạt của các dòng chọn lọc 43

3.2.2. Hàm lượng amino acid liên kết trong hạt của một số dòng chọn lọc và

giống gốc . 45

3.2.3 Nhận xét về chất lượng hạt của các dòng lạc chọn lọc

3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc 49

3.3.1 Khả năng chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm các dòng chọn lọc thế hệ

R4 . 49

3.3.1.1. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ α – amylase trong giai đoạn hạt

nảy mầm 49
3.3.1.2. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hàm lượng đường tan trong giai đoạn hạt

nảy mầm . 52

3.3.1.3. Môi tương quan giưa hoat đô α-amylase va ham lương đương tan 55

3.3.1.4. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc và giống gốc trong điều

kiện hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm . 56

3.3.2. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các dòng chọn lọc thế hệ

R4 . . . 56

3.3.2.1 Khối lượng tươi, khô của rễ, thân lá và chiều dài rễ cây non 3 lá sau khi

xử lý hạn . 57

3.3.2.2 Ảnh hưởng của hạn nhân tạo đến tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước và

chỉ số chịu hạn tương đối của các giống lạc ở giai đoạn cây non . 61

3.3.2.3 Khả năng phục hồi của các dòng chọn lọc khi gây hạn nhân tạo . 63

3.3.2.4 Sự biến đổi hàm lượng proline trong giai đoạn cây non trong điều kiện

hạn nhân tạo 64

3.3.2.5. Mối tương quan giữa hàm lượng proline và chỉ số chịu hạn . 66

3.3.2.6 Nhận xét về khả năng chịu hạn cua cac dòng lạc và giống gốc ơ giai

đoan cây non

67
3.4. Đánh giá sự thay đổi ADN genome một số dòng chọn lọc bằng kĩ

thuật RAPD .

69
3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số 69
3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RAPD . 70
3.4.3. So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc và giống gốc ở mức độ
phân tử 73
3.4.4. Nhận xét về đa hình RAPD 75
Kết luận . 76
Công trình đã công bố liên quan đến luận văn . . 77
Tài liệu tham khảo 78


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.
Diện tích, năng suất, sản lượng lạc trên thế giới từ năm 2000-2008 Trang

6
Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng lạc ở Việt Nam từ 2000 – 2008 7
Bảng 2.1. Các dòng chọn lọc ở thế hệ R3 và giống gốc 18
Bảng 2.2. Thành phần hóa chất trong phân tích hàm lượng - amylase 23
Bảng 2.3. Trình tự 5 mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD 27
Bảng 3.1. Đặc điểm nông học của các dòng lạc R2 . 30
Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất ở các dòng thế hệ R2 . 32
Bảng 3.3. Giá trị Tα, Ttn của các đặc điểm nông học thế hệ R2 35
Bảng 3.4 Đặc điểm nông học của các dòng lạc thế hệ R3 . 37
Bảng 3.5 Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất của của các dòng thế hệ R3 . 39
Bảng 3.6. Giá trị Tα, Ttn của các đặc điểm nông học thế hệ R3 . 40
Bảng 3.7 Một số chỉ tiêu hóa sinh trong hạt các dòng thế hệ R3 44
Bảng 3.8 Hàm lượng amino acid liên kết trong hạt của một số dòng chọn lọc và
giống gốc thế hệ R3 45
Bảng 3.9 Hàm lượng amino acid liên kết trong protein hạt của một số dòngchọn lọc
thế hệ R3 và giống gốc . 47
Bảng 3.10 Thành phần va ham lương cac amino acid không thay thê trong hat cua cac
dòng lạc 47
Bảng 3.11. Hoạt độ của -amylase trong giai đoan hat nay mâm khi xư ly sorbitol10% 50
Bảng 3.12. Hàm lượng đường tan trong giai đoan hat nay mâm khi xư ly sorbitol10% 52
Bảng 3.13. Tương quan giữa hoạt độ của α-amylase và hàm lượng đường ở giai đoạn
hạt nảy mầm . 55
Bảng 3.14. Khối lượng tươi, khô của thân lá cây non 3 lá sau khi xử lý hạn 57
Bảng 3.15. Khối lượng tươi, khô của rễ cây non 3 lá sau khi xử lý hạn 58
Bảng 3.16. Chiêu dài rễ của các dòng lạc ở giai đoạn cây non thế hệ R4 . . 60
Bảng 3.17. Tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước và chỉ số chịu hạn tương đối của các
giống lạc ở giai đoạn cây non thế hệ R4 62
Bảng 3.18. Khả năng phục hồi của các dòng lạc chọn lọc sau khi gây hạn nhân tạo 64

Bảng 3.19. Hàm lượng prolin của thân lá của các dòng lạc ở giai đoạn cây non các

dòng chọn lọc thế hệ R4 65

Bảng 3.20. Tương quan giữa chỉ số chịu hạn và hàm lượng proline 67

Bảng 3.12. Hàm lượng và độ tinh sạch của ADN tổng số tách từ các dòng chọn lọc . 70

Bảng 3.22 Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD 70
với 5 mồi ngẫu nhiên .

Bảng 3.23 Tỷ lệ phần trăm phân đoạn đa hình khi sử dụng 5 mồi RAPD 71

Bảng 3.24 Hệ số sai khác di truyền của 3 dòng lạc giống L23 và giống gốc . 74

DANH MỤC HÌNH




Trang


Hình 3.1. Một số hình ảnh dòng R2.9 và giống gốc 36

Hình 3.2 Một số hình ảnh dòng chọn lọc thế hệ R3 . 42

Hình 3.3 Sắc kí đồ amino acid của dòng R3.26 (giống MD7) 46

Hình 3.4. Biểu đồ hàm lượng amino acid không thay thê cua cac dòng lạc

nghiên cưu vơi giống gốc . . 48

Hình 3.5. Sư biên đông hoat đô α-amylase cua cac dòng lạc thế hệ R4 có

nguồn gốc mô sẹo chịu mất nước giống MD7 52

Hình 3.6. Biểu đồ sư biên đông hàm lượng đường tan của các dòng lạc thế hệ

R4 giống L18 54

Hình 3.7. Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các dòng và giống

gốc MD7 ở giai đoạn cây non 63

Hình 3.8. Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các dòng và giống

gốc R23 ở giai đoạn cây non 63

Hình 3.9. Sư biên đông ham lương prolin e ở giai đoạn cây non của các dòng

thuộc giống MD7, L18 và giống gốc . 66

Hình 3.10. Một số hình ảnh giai đoạn cây non, chiều dài rễ của các dòng chọn

lọc thế hệ R4 trước và sau khi gây hạn và phục hồi . 68

Hình 3.11. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các giống lạc 69

Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M1

và M2 . 72

Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M3

và M4 . 72

Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M5 73

Hình 3.15. Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 3 dòng lạc giống L23 và giống gốc 75

CHỮ VIẾT TẮT


ABA Abscisic Acid

ADN Deoxyribose Nucleic Acid

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài

các phân đoạn được nhân bản) ASTT Áp suất thẩm thấu
CS Cộng sự

CNSH Công ngệ sinh học CSCHTĐ Chỉ số chịu hạn tương đối ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ
ĐHSP Đại học sư phạm

HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)

LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi)
Kb Trạng Quỳnhbase

KLK Khối lượng khô

MGPT Môi giới phân tử

MS Murashige Skoog (Môi trường theo Murashige và Skoog) NXB Nhà xuất bản
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD Random Amplified Polymorphism ADN (Phân tích ADN đa hình

được nhân bản ngẫu nhiên)

HSP Protein sốc nhiệt

LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi)
PTNT Phát triển nông thôn