Thạc Sĩ Đánh giá khả năng tái sinh in vitro của các giống lúa indica và biến nạp gen cryIAc vào lúa thông qu

Luận văn thạc sĩ
Đề tài: Đánh giá khả năng tái sinh in vitro của các giống lúa indica và biến nạp gen cryIAc vào lúa thông qua Agrobacterium tumefaciens
Mô tả bị lỗi font vài chữ, file tài liệu thì bình thường


MỤC LỤC
Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữviết tắt và thuật ngữ vi Danh mục bảng vii
Danh mục hình viii
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3
1.3 Nội dung nghiên cứu 3
1.4 ðịa ñiểm nghiên cứu 3
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Cơsởkhoa học của xây dựng, ñánh giá khảnăng tái sinh 4
2.1.1 Cơsởkhoa học của xây dựng và ñánh giá khảnăng tái sinh 4
2.1.2 Cơsởdi truyền của công nghệsinh học bảo vệthực vật 4
2.1.3 Một sốhệthống tái sinh sửdụng cho biến nạp gen 5
2.1.4 Những thay ñổi di truyền xảy ra trong quá trình nuôi cấy in vitro 6
2.2 Agrobacterium tumefaciens và cơchếchuyển gen vào thực vật 8
2.2.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 8
2.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 9
2.2.3 Cấu trúc và chức năng của các ñoạn T-DNA 10
2.2.4 Cơchếphân tửcủa việc chuyển gen thông qua Agrobacterium
tumefaciens 10
2.2.5 Tương tác giữa T-DNA và genome tếbào thực vật 12
2.2.6 Một sốphương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens 14
2.3 Hệthống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩnAgrobacterium
tumefaciens 15
2.3.1 Hệvector hai nguồn 15
2.3.2 Hệvector liên hợp 16
2.3.3 Các gen chỉthịchọn lọc và các gen thông báo trong hệthống
vector biến nạp 18
2.4 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry 20
2.4.1 Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis 20
2.4.2 Những nghiên cứu vềgen cry 23
2.4.3 Cấu trúc và chức năng của protein tinh thể ñộc 23
2.4.4 Một sốnghiên cứu vềgen cry1Ac 25
2.5 Nguồn gốc và phân loại cây lúa 27
2.6 Tình hình nuôi cấy mô lúa và chuyển gen vào lúa thông qua
Agrobacterium tumefaciens 29
2.6.1 Trên thếgiới 29
2.6.2 ỞViệt Nam 30
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
3.1 Vật liệu 33
3.1.1 Vật liệu thực vật 33
3.1.2 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensvà vector biến nạp 34
3.1.3 Hóa chất và dụng cụthí nghiệm 35
3.1.4 Môi trường nuôi cấy 36
3.2 Phương pháp nghiên cứu 39
3.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tếbào 39
3.2.2 Phương pháp ñánh giá khảnăng tái sinh in vitro 39
3.2.3 Biến nạp gen cry1Ac thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens 40
3.2.4 Phương pháp thu thập và phân tích sốliệu thống kê thu ñược 42
3.2.5 Phân tích cây ñược biến nạp gen 42
4 KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 46
4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổhợp các phytohocmon (2,4D, BAP,
NAA) ñến khảnăng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của
giống lúa IR64 46
4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổhợp 2,4D và hỗn hợp axít amin ñến
khảnăng tạo mô sẹo và tái sinh cây của giống lúa IR64 46
4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổhợp (BAP và NAA) ñến khảnăng
tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR64 49
4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến khảnăng tạo
mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR 64 51
4.2 ðánh giá khảnăng tạo mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây hoàn
chỉnh của các giống lúa indica trên môi trường và ñiều kiện tối
ưu cho giống lúa IR64 52
4.4 Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen (mang gen cry1Ac)thông qua
vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens 57
4.5 Xác ñịnh sựtồn tại của gen chuyển trong hệgen lúa sửdụng
PCR 59
4.6 ðánh giá kiểu hình cây chuyển gen 60
5 KẾT LUẬN VÀ ðỀNGHỊ 61 5.1 Kết luận 61
5.2 ðềnghị 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63
PHỤLỤC 72


1. MỞ ðẦU
1.1 ðặt vấn ñề
Cây lúa (Oryza sativa L.) là m ột trong những cây lương thực quan
trọng nhất trên thếgiới với hơn 3 tỷngười sửdụng hàng ngày. Cây lúa ñược
trồng chủyếu ởvùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới của các châu lục. Trong ñó,
khoảng 90 % diện tích lúa trồng trên thếgiới thuộc vềchâu Á. Khoảng 80 %
sản lượng lúa thếgiới là của các giống indica. ỞViệt Nam, lúa là cây lương
thực quan trọng nhất, chiếm hơn 60 % tổng sản lượng lương thực và ñược
gieo trồng 3,96 triệu hecta - là cây có diện tích lớn nhất ởViệt Nam. Do ñó,
nghiên cứu về cây lúa ñã và ñang ñược quan tâm sâu sắc của nhiều nhà
nghiên cứu.
ðể ñảm bảo an ninh lương thực trong ñiều kiện dân số thế giới tăng
nhanh hiện nay, cần khẩn cấp gia tăng sản lượng lúa gạo. Trong ñiều kiện diện
tích ñất, nguồn nước sửdụng cho nông nghiệp bịgiảm ñi nhanh và yêu cầu
giảm thiểu sửdụng hoá chất nông nghiệp, việc chọn tạo các giống lúa có năng
suất cao, chất lượng tốt, có khảnăng kháng với sâu, bệnh, các tác nhân vô sinh
ñang ñòi hỏi cấp thiết.
Phương pháp chọn tạo giống truyền thống ñã thu ñược nhiều giống có
năng suất cao, sửdụng trong cuộc cách mạng xanh. Tuy nhiên, ñểtạo ra các
giống mới bằng các phương pháp truyền thống thường mất 3- 4 năm. Do ñó,
ñểtạo ra các giống lúa mới mang tính trạng mong muốn trong thời gian ngắn
hơn, các phương pháp truyền thống cần kết hợp với những kết quảthu ñược
do phương pháp Công nghệsinh học tạo ra.
Việc tạo ra các giống cây trồng biến ñổi di truy ền có khảnăng kháng
sâu, bệnh và côn trùng nhờkỹthuật chuy ển gen thực vật ñang ñược quan tâm
nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất và tính chống
chịu của cây trồng ñể ñem lại lợi ích tối ña cho nền nông nghiệp.
Biến nạp gen là một trong các chiến lược quan trọng ñược sửdụng ñể
ñưa gen phân lập từcơthểnào ñó vào cây trồng trong cùng hoặc khác loài,
tạo ra những cây biến ñổi gen có tính trạng mong muốn. Có 2 phương pháp
chuyển gen ñang ñược áp dụng phổbiến hiện nay là dùng súng bắn gen và sử
dụng vi khuẩn Agrobacterium. Tuy nhiên, chuy ển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacteriumphổbiến hơn vì giá thành rẻ, thao tác ñơn giản, hiệu quảcao.
Hiệu quảbiến nạp gen lúa phụthuộc vào nhiều yếu tố: phương pháp
biến nạp, giống, mô sửdụng ñểbiến nạp, thành phần môi trường nuôi cấy,
chất ñiều hòa sinh trưởng, và ñiều kiện tái sinh cây (Ge và cs., 2006). Nhiều
nghiên cứu ñã chỉra ởcác giống lúa indicahiệu quảtạo mô sẹo và tái sinh
cây in vitro thấp hơn ởcác giống japonicavà phụthuộc ñáng kểvào từng
giống (Amin và cs., 2004; Khanna H. K. và cs.,1999). Do ñó, ñểtăng hiệu
quảtạo mô sẹo và tái sinh cây cần thiết tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho
các giống.
Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu lương thực chủlực trên
thếgiới. ðểduy trì ưu thếcạnh tranh và tăng cường sản lượng, năm 2006,
Chính phủViệt Nam ñã phê duyệt chương trình trọng ñiểm phát triển và ứng
dụng công nghệsinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn
ñến năm 2020. Tầm nhìn ñến 2020, diện tích trồng trọt các giống cây trồng
mới tạo ra bằng các kỹthuật của công nghệsinh học chiếm trên 70 %. Trong
ñó, diện tích trồng trọt các giống cây trồng biến ñổi gen chiếm 30- 50 %.
(Website http: //.www. bonongnghiepvaphattriennongthon ).
Trên cơ sở ý nghĩa lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñềtài: “ðánh giá khảnăng tái sinh in vitro
của các giống lúa indica và biến nạp gen cryIAc vào lúa thông qua
Agrobacterium tumefaciens”.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
ã Chọn ñược môi trường thích hợp và tối ưu các ñiều kiện nuôi cấy ñể
tạo mô sẹo và tái sinh cây giống lúa IR64.
ã ðánh giá ñược khảnăng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các giống lúa
indicatrên môi trường và ñiều kiện nuôi cấy ñã tối ưu cho giống lúa IR64.
ã Bước ñầu nghiên cứu tạo cây lúa indicabiến nạp mang gen cryIAc
kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
1.3 Nội dung nghiên cứu
 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các phytohocmon (2,4-D, BAP,
NAA) ñến khảnăng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR64
 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy (nhiệt ñộ, ánh sáng, )
ñến khảnăng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR64
 ðánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của các
giống lúa indicatrên môi trường và ñiều kiện ñã tối ưu cho giống lúa IR64
 Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen (mang gen cryIAc) thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens
 Xác ñịnh sựhợp nhất của gen chuyển trong hệ gen lúa sửdụng kỹ
thuật PCR
1.4 ðịa ñiểm nghiên cứu
Phòng Thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di
truy ền Nông nghiệp.
Thời gian nghiên cứu: 15 / 06 / 2009 ñến 15 / 08 / 2010
1.5 Ý nghĩa khoa học
ðềtài xây dựng nền tảng nuôi cấy tái sinh in vitrophục vụcho chiến
lược chuyển gen vào các giống lúa indica thông qua mô sẹo. Bước ñầu nghiên
cứu tạo cây lúa chuyển gen kháng sâu, từng bước chọn tạo ra giống lúa mới.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình và Lê ThịMuội(1998), “Phân lập gen và chọn dòng chống
chịu ngoại cảnh bất lợi ởcây lúa”, NXB ðại học Quốc gia Hà Nội
2. Bùi Bá Bổngvà Cs., (1997), “Kết quảnuôi cấy túi phấn của cây lúa“, Tạp
chí Sinh Học, 19 (3): 31 – 34.
3. Nguyễn Thị Hồng Châu và Cs., (2003), “Chuy ển gen thông qua
Agrobacterium tumefaciens vào giống lúa C71“, Tạp chí Công nghệ
sinh học 1 (2): 219 – 226
4. Nguyễn Mạnh ðôn, (2001), “Nuôi cấy bao phấn lúa indica“, Tạp chí khoa
học và công nghệ, trang 78 – 80.
5. Nguyễn ðình Giao, Nguyễn Thiện Huyên và Cs., (2001), “Giáo trình
cây lương thực (tập 1) cây lúa“, NXB Nông Nghiệp
6. Lê ThịThu Hiền, (2003), “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang gen
kháng côn trùng ñểchuyển vào cây trồng” Luận án tiến sỹSinh học,
Viện Công nghệSinh học, Viện Khoa học và Công nghệViệt Nam.
7. Trần ThịCúc Hòa, Bùi Bá Bổng, (2003). “Hiệu quảchuyển gen thông
qua vi khuẩn A. tumefacients của lúa (Oryza sativa L.) sử dụng hệ
thống chọn lọc mannose”. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông
thôn 1+2: 60-63.
8. Nguyễn Văn Hoan, (2006),“Cẩm nang cây lúa“, NXB Lao ðộng
9. Nguyễn ThịThanh Huyềnvà Cs.,(2003), “Ảnh hưởng của mối tương tác
giữa nguồn gen lúa và môi trường nuôi cấy ñến hiệu quảnuôi cấy bao
phấn lúa“, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số3/2003,
trang 266 – 268.
10. Võ ThịThương Lan, (2006), “Giáo trình sinh học phân tửtếbào và ứng
dụng“, NXB Giáo dục, Hà Nội
11. HồHữu Nhị, Hoàng ThịYên,(1996), “Khảnăng tái sinh in vitro và duy
trì m ức ñộbất dục cao của một sốdòng lúa bất dục“, Tạp chí Sinh Học,
18 (2): 29 – 32
12. TạKim Nhung, (2009), “Nghiên cứu khảnăng tiếp nhận gen kháng sâu
(CryIAc) của một số dòng ngô Việt Nam thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”, luận văn Thạc sỹkhoa học, Trường ðại
học khoa học tựnhiên – ðại học Quốc gia Hà Nội.
13. Cao LệQuyên, (2008), “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen ñiều khiển
tính chịu hạn vào một sốgiống lúa ởViệt Nam“, luận văn thạc sỹkhoa
học – Trường ðại học khoa học tựnhiên, ðại học Quốc gia Hà Nội.
14. Cao LệQuyên, Lê Kim Hoàn, Phạm Xuân Hội, Lê Huy Hàm (2008),
“Nghiên cứu khảnăng tái sinh cây lúa từphôi của tập ñoàn giống lúa
Việt Nam nhằm phục vụcông tác chuyển gen”, Tạp chí Sinh học, tập 3,
tr, 141-147
15. Nghiêm ThịNhưVân, (1989), “Sựhình thành mô sẹo từhạt phấn bên
trong bao phấn lúa ñược nuôi cấyin vitro“, Tạp chí Sinh Học, 11 (2):
27 – 30.
16. ðỗ Năng Vịnh, (2002), “Công nghệ sinh học cây trồng“, NXB Nông
Nghiệp
17. ðỗ Năng Vịnh, (2005), “Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng“, NXB
Nông nghiệp
18. Websitehttp://.www. bonongnghiepvaphattriennongthon