Luận Văn Đánh giá hiệu quả của ba phương pháp nuôi cấy tế bào ối và quy cách sử dụng demecolcine khi tạo tiêu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM - hướng Sinh lý động vật
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – Tháng 6/2011

MỤC LỤC ( LUẬN VĂN DÀI 128 TRANG CÓ FILE WORD)

Phụ lục bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt i
Danh mục các bảng, hình và biểu đồ ii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tế bào ối người 3
2.2. Nuôi cấy tế bào 7
2.3. Nuôi cấy tế bào ối người 9
2.4. Các kỹ thuật kiểm tra số lượng và cấu trúc NST 11
2.5. Demecolcine 14
2.6. Một số các nghiên cứu về nuôi cấy tế bào ối người trên thế giới và
ở Việt Nam 16
CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thực hiện 20
3.2. Nội dung nghiên cứu 20
3.3. Thiết bị và hóa chất 21
3.4. Phương pháp nghiên cứu 22
3.5. Phương pháp toán học sử dụng trong nghiên cứu 31
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định phương pháp nuôi cấy hiệu quả 32
4.2. Bước đầu xác dịnh liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất
này khi tạo tiêu bản NST thai 58
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận 72
5.2. Đề nghị 73
Công trình của tác giả đã công bố 74
Tài liệu tham khảo 75
Phụ lục
DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
1. Các bảng


Bảng 3.1: Phân bố theo tình trạng lẫn máu mẹ của các mẫu ối

Bảng 3.2: Tuổi thai của các mẫu vào thời điểm chọc ối

Bảng 4.1: Tỷ lệ thành công của 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối

Bảng 4.2: Số lượng các mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển

Bảng 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian xuất hiện tế bào bám và tạo cụm ở các phương pháp
Bảng 4.4: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (+) ở các
phương pháp

Bảng 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) của các mẫu ối ở các phương pháp
Bảng 4.6: Thời gian nuôi cấy tế bào ối ở 3 phương pháp

Bảng 4.7: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức (+) của các mẫu ối có tuổi thai khác nhau
Bảng 4.8: Phân bố (%) số mẫu theo thời gian bám và tạo cụm của các mẫu ối ở các nhóm có tình trạng lẫn máu mẹ khác nhau
Bảng 4.9: Số cụm NST trung bình trong một quang trường của các lô thí nghiệm
Bảng 4.10: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các lô thí nghiệm
Bảng 4.11: Trung bình số cụm NST trong một quang trường theo liều



Trang
23

23

33
38


41


42

44

46

51


56


59

64


lượng demecolcine xử lý mẫu trong 60 phút 68
Bảng 4.12: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các liều lượng demecolcine khác nhau xử lý mẫu trong 60 phút 68
Bảng 4.13: Trung bình số cụm NST trong một quang trường ở các lô 69 theo thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25 µg/ml
Bảng 4.14: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung của các lô thí nghiệm ở 70 các mức thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25 µg/ml
2. Hình
Hình 2.1: Hình minh họa thủ thuật chọc ối dưới sự hỗ trợ của siêu âm 3
Hình 2.2: Hình minh họa việc nuôi cấy tế bào thu nhận từ dịch ối 5
Hình 2.3: NST hiện băng tạo bởi các kỹ thuật nhuộm khác nhau 13
Hình 4.1: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có nhiều tế bào đang phân chia (100x)
Hình 4.2: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ dày mức độ trung bình (100x)
Hình 4.3: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ che phủ mức độ dày (100x)
Hình 4.4 (a), (b): Các cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ che phủ mức độ rất dày (100x)
Hình 4.5: Một số mẫu thu hoạch của phương pháp 2 và phương pháp 3 48
Hình 4.6: Các tế bào ở giai đoạn khác nhau trong quá trình phân bào (200x)
Hình 4.7: Các tế bào có bộ NST ở trạng thái khác nhau (200x) 63
Hình 4.8: Bộ NST vẫn còn tế bào chất tạo lớp mờ bao bọc bộ NST và độ bung mức + (200x)
Hình 4.9: Hai cụm NST có độ bung mức ++ và +++ (200x)
Hình 4.10: Bộ NST có độ bung mức +++ (A) và NST đồ tương ứng (B)
66
3. Biểu đồ
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ thành công – thất bại ở 3 phương pháp 35
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển 36
Biểu đồ 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) ở các phương pháp
Biểu đồ 4.4: Thời gian nuôi cấy ở 3 phương pháp 47
Biểu đồ 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức (+) ở 2 nhóm tuổi thai 53
Biểu đồ 4.6: Phân bố (%) mẫu theo thời gian bám và tạo cụm ở các nhóm có tình trạng lẫn máu mẹ khác nhau
Biểu đồ 4.7: Số cụm NST trung bình của các lô theo liều lượng demecolcine và thời gian xử lý với chất này
Biểu đồ 4.8: Số cụm NST trung bình ở các lô theo theo thời gian xử lý với
liều demecolcine 0,25µg/ml 70


MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lý nhiễm sắc thể (NST) là một trong những nguyên nhân gây dị tật bẩm sinh cho thai nhi. Những dị tật nặng sẽ gây sẩy thai, thai lưu hoặc trẻ sẽ chết sau sinh. Ví dụ như các dạng đột biến thể tam nhiễm liên quan 52% với các trường hợp sẩy thai, trong đó hội chứng Tơcnơ (Turner) (45,XO) liên quan 18% trường hợp sẩy thai, chiếm tỷ lệ cao nhất; tiếp đến là tam nhiễm cặp NST số 16 liên quan 16,4% trường hợp, các đột biến dạng chuyển đoạn không tương hỗ liên quan 3% . [49]. Những dị tật nhẹ như chậm phát triển trí tuệ hay vô sinh không đe dọa tính mạng của thai nhi, nhưng thường không điều trị được, chúng tồn tại suốt cuộc đời của trẻ. Do đó tạo ra gánh nặng cho xã hội cũng như những rối loạn về tâm sinh lý khi trẻ trưởng thành. Vì vậy cần hạn chế việc sinh ra những trẻ dị tật do bệnh lý NST ngay từ trước khi sinh và đó là vai trò quan trọng của chẩn đoán tiền sản.
Một trong những phương pháp chẩn đoán tiền sản khá phổ biến hiện nay là phân tích NST. Phân tích NST cùng với khám, siêu âm theo dõi, làm các xét nghiệm cần thiết đã giúp xác định được đến 99,3% trong tổng số ca dị tật được phát hiện (số liệu tại bệnh viện Từ Dũ từ tháng 6/2000 đến tháng 6/2001). Đối với các trường hợp nghi ngờ thai nhi mang các bất thường về cấu trúc hoặc số lượng NST, việc phân tích NST có thể được thực hiện qua chọc rút nước ối (chọc ối) sau đó nuôi cấy tế bào nước ối thai nhi, hoặc nuôi cấy tế bào lympho của máu đứa trẻ, sau đó dùng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (kỹ thuật FISH) hay nhuộm (nhuộm thường quy hoặc nhuộm băng) khảo sát NST đồ. Đây là các xét nghiệm có ích lợi rất lớn, không những giúp chẩn đoán mà còn có thể giúp bác sĩ điều trị dự đoán khả năng bất thường đó xuất hiện lại ở những đứa con sau [2].
Xét nghiệm bằng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang cho kết quả nhanh hơn, chỉ mất khoảng 5 ngày – 1 tuần, tuy nhiên xét nghiệm này rất đắt tiền và chỉ khảo sát được bất thường về số luợng của cặp NST số 13, 18, 21 và cặp NST giới tính. Khuynh hướng xét nghiệm sàng lọc trước sinh hiện nay ở nước ta đang nghiêng về kỹ thuật nhuộm băng khảo sát NST đồ. Kỹ thuật này cho phép khảo sát cả đột biến số lượng và cấu trúc bộ NST của thai nhi với chi phí rẻ hơn khoảng 10-20%. Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là mất thời gian khá lâu để có được kết quả, khoảng 2 – 2,5 tuần. Bên cạnh đó việc tiến hành kỹ thuật này đến nay vẫn chưa cho kết quả ổn định, tỷ lệ nuôi cấy thành công và thời gian nuôi cấy tế bào chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tuổi thai, tình trạng lẫn máu mẹ, phương pháp nuôi cấy tế bào ối Phương pháp nuôi cấy tế bào ối bằng bình cấy flask được dùng phổ biến hiện nay có thời gian nuôi cấy dài và tiêu hao hóa chất hơn và khi tạo tiêu bản NST chưa cho nhiều cụm NST so với các phương pháp nuôi cấy in situ.
Nhằm chọn ra phương pháp nuôi cấy tế bào ối vừa hiệu quả vừa tiết kiệm, đồng thời xem xét kỹ thuật tối ưu thu hoạch tiêu bản NST chất lượng tốt khi dùng demecolcine xử lý mẫu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hiệu quả của ba phương pháp nuôi cấy tế bào ối và quy cách sử dụng demecolcine khi tạo tiêu bản NST thai”.
1.2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
(1) Lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế bào ối hiệu quả
(2) Xác định liều lượng demecolcine và thời gian xử lý mẫu với chất này để tạo tiêu bản NST tốt.