Luận Văn Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng dendrobium thu thập tại tỉnh bình phước và thị xã bảo

TÓM TẮT
. “Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phước và thị xã Bảo Lộc (tỉnh Lâm Đồng) bằng kỹ thuật RAPD”
Đề tài được tiến hành tại Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và công nghệ môi trường – Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007 nhằm giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD, làm tiền đề phục vụ cho công tác chọn, tạo giống lan. Đề tài bao gồm các nội dung: ly trích DNA tổng số từ lá lan; tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR với marker RAPD; thực hiện phản ứng PCR với các điều kiện đã được tối ưu và cuối cùng xây dựng cây phân nhóm di truyền bằng các phần mềm NTSYSpc 2.1 và Winboot. Kết quả cho thấy, có 6 trên 10 primer RAPD (OPAC10, OPB01, S1384, OPB08, U693, OPAH13) tạo ra sản phẩm khuếch đại với 20 mẫu lan nghiên cứu. Tổng cộng có 57 băng được tạo ra, trong đó có 55 băng đa hình chiếm tỉ lệ 96,5% và 2 băng đồng hình chiếm tỉ lệ 3,5%; Trung bình có 9,1 băng đa hình/primer. Sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 180 – 3000 bp. Phân tích dữ liệu RAPD cho thấy nếu xét mức độ tương đồng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở 0,55 thì sẽ chia thành ba nhóm với mức độ tương đồng di truyền biến thiên trong khoảng từ 0,55 – 0,66. Ba nhóm này bao gồm hai nhóm chính (nhóm 1 và 2) và một nhóm phụ (nhóm 3). Ngoài ra, các loài lan Vẩy Rồng (Bảo Lộc), Vẩy Rồng (Bình Phước), Thái Bình (Bình Phước) và Long Nhãn (Bình Phước) không phân nhóm mà chúng nằm rải rác trên cây phát sinh loài. Điều này cho thấy các loài lan rừng giống Dendrobium khảo sát có sự đa dạng cao về di truyền.

MỤC LỤC Trang tựa i
Lời cảm tạ . iii
Tóm tắt . iv
Summary v
Mục lục . vi
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình . x
Danh sách các chữ viết tắt xi
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục đích – yêu cầu đề tài . 2
1.2.1. Mục đích . 2
1.2.2. Yêu cầu . 2
1.3. Giới hạn đề tài . 2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về cây hoa lan . 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố các loài phong lan. 3
2.1.2. Các đặc tính chủ yếu của loài lan ký sinh . 4
2.1.3. Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium . 7
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái 8
2.1.3.2. Điều kiện sinh thái 9
2.1.4. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 9
2.1.4.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới 9
2.1.4.2. Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam 10
2.2. Giới thiệu về đa dạng sinh học 12
2.2.1. Định nghĩa 12
vii
2.2.2. Các phân mức về đa dạng sinh học 12
2.2.2.1. Sự đa dạng về hình thái . 12
2.2.2.2. Đa dạng loài 12
2.2.2.3. Sự đa dạng về di truyền . 13
2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 14
2.3.1. Phương pháp sử dụng các marker hình thái . 14
2.3.2. Phương pháp sử dụng các marker isozyme 14
2.3.3. Phương pháp sử dụng các marker phân tử . 15
2.4. Quy trình ly trích DNA tế bào thực vật . 15
2.5. Kỹ thuật PCR 17
2.5.1. Khái niệm và nguyên tắc của kỹ thuật PCR . 17
2.5.2. Thành phần phản ứng PCR 19
2.5.3. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR 20
2.6. Một số marker phân tử thường dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền . 21
2.6.1. Marker RFLP . 22
2.6.2. Marker AFLP . 22
2.6.3. Marker RAPD 23
2.6.4. Marker SSR 25
2.7. Cây phát sinh loài 26
2.7.1. Một số thuật ngữ 26
2.7.2. Những cách vẽ cây phát sinh loài 26
2.7.3. Các phương pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài . 27
2.8. Các công trình nghiên cứu khoa học có liên quan 27
2.8.1. Tình hình nghiên cứu khoa học trên cây lan ngoài nước . 27
2.8.2. Tình hình nghiên cứu khoa học trên cây lan trong nước . 28
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 30
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 30
3.2. Vật liệu 30
3.2.1. Các loài lan rừng giống Dendrobium . 30
viii
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm . 34
3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm 35
3.3. Phương pháp . . 36
3.3.1. Quy trình ly trích DNA tổng số . 36
3.3.2. Kiểm tra định tính và định lượng DNA . 37
3.3.2.1. Định tính DNA bằng phương pháp điện di . 37
3.3.2.2. Định lượng DNA bằng phương pháp đo OD 38
3.3.3. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR với marker RAPD 38
3.3.4. Thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD . 42
3.3.5. Phương pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS . 43
3.3.6. Phân tích Boostrap bằng phần mềm Winboot 44
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 45
4.1. Sản phẩm ly trích DNA tổng số 45
4.2. Hoàn thiện quy trình PCR với marker RAPD . 48
4.3. Đánh giá đa dạng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phước và thị xã Bảo Lộc tỉnh Lâm Đồng . 52
4.3.1. Sản phẩm PCR với marker RAPD . 52
4.3.2. Phân tích nhóm của 10 loài lan rừng giống Dendrobium dựa trên dữ liệu RAPD . 58
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 65
5.1. Kết luận . 65
5.2. Đề nghị 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67
PHỤ LỤC
ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG
Bảng 3.1 Danh sách các loài lan rừng giống Dendrobium nghiên cứu . 30
Bảng 3.2 Danh sách các primer dùng trong nghiên cứu 35
Bảng 3.3 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 38
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR . 39
Bảng 3.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của số chu kỳ đến sản phẩm RAPD 39
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm 1 . 40
Bảng 3.7 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD . 40
Bảng 3.8 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD . 41
Bảng 3.9 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Taq đến sản phẩm RAPD . 41
Bảng 3.10 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD . 42
Bảng 3.11 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dNTPs đến sản phẩm RAPD . 42
Bảng 4.1 OD của 20 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD 47
Bảng 4.2 Nồng độ tối ưu các thành phần của phản ứng PCR 52
Bảng 4.3 Chương trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR 52
Bảng 4.4 Danh sách các primer được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium . 53
Bảng 4.5 Hệ số tương đồng di truyền của các loài lan rừng giống Dendrobium khảo sát . 58
x

DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG
Hình 2.1 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 18
Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 24
Hình 3.1 Các loài lan rừng giống Dendrobium nghiên cứu . 33
Hình 4.1 DNA tổng số của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở Bảo Lộc . 46
Hình 4.2 DNA tổng số của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở Bình Phước 46
Hình 4.3 Khảo sát ảnh hưởng của số chu kỳ 49
Hình 4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ primer 49
Hình 4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ . 50
Hình 4.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Taq . 50
Hình 4.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ DNA mẫu 51
Hình 4.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dNTPs 51
Hình 4.9 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phước (hình b) 55
Hình 4.10 Sản phẩm PCR với primer OPB01 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phước (hình b) 56
Hình 4.11 Sản phẩm PCR với primer S1384 của 10 mẫu lan thu thập ở Bảo Lộc (hình a) và Bình Phước (hình b) 57
Hình 4.12 Cây phân nhóm di truyền giữa 10 loài lan rừng giống Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phước và thị xã Bảo Lộc 60
Hình 4.13 Đồ thị phân bố nhóm dựa trên dữ liệu RAPD . 61
xi