Luận Văn Đánh giá các dạng bảo quản kháng nguyên nọc rắn

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Đánh giá các dạng bảo quản kháng nguyên nọc rắn


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . i
PHẦN MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 5
I.TỔNG QUAN VỀ RẮN 5
1. Đặc điểm cơ bản về rắn 6
2. Bản chất sinh hóa và các tác động của nọc rắn lên cơ thể người[1]. 9
2.1. Thành phần hóa học của nọc độc rắn 9
2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính độc của nọc rắn 10
2.3. Các tác động của nọc rắn lên cơ thể người 12
3. Rắn Hổ Đất 15
3.1. Phân loại khoa học . 15
3.2. Hình dáng: 15
3.3. Sinh thái và tập tính 16
3.4.Phân bố . 17
3.5. Nọc độc và thành phần chính 17
II. CÁC DẠNG BẢO QUẢN . 18
1. Đông Khô 20
2. Dạng dung dịch . 22
2.1. Nước muối sinh lý 22
2.2. Glycerol 22
CHƯƠNG II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 25
I.VẬT LIỆU . 25
1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU . 25
2.MÁY MÓC VÀ DỤNG CỤ . 25
iii
2.1.Máy móc 25
2.2. Dụng cụ 25
3. HÓA CHẤT VÀ DUNG MÔI 26
3.1. Hoá chất . 26
3.2. Dung môi . 27
II.PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 28
1. KIỂM TRA LD50 . 29
1.1.Mục đích : . 29
1.2.Tiến hành 29
2. KIỂM TRA TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA KHÁNG NGUYÊN . 31
2.1. Nguyên tắc . 31
2.2. Tiến hành: 33
3. KIỂM TRA HÀM LƯỢNG PROTEIN . 34
3.1. Nguyên tắc . 34
3.2. Tiến hành . 35
CHƯƠNG III:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ36
I. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined.
II. KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined.
III. KIẾN NGHỊ . 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56
DANH MỤC HÌNH iv
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Sơ đồ hướng tiến hành đề tài .1
Hình 2.2. Bảng thăm dò giá trị LD
50
của dung dịch nọc rắn mẹ . 30
Hình 2.3. Bảng nồng độ pha tiêm của dung dịch nọc rắn 30
Hình 2.2: kháng nguyên đồng nhất tương ứng với kháng thể 32
Hình 2.3: các kháng nguyên có một phần tương ứng với một phần khác nhau của
kháng thể 33
Hình 2.4: kháng nguyên cùng có một phần tương ứng với kháng thể 33
Hình 2.5. Sơ đồ tra mẫu 34
Hình 3.1. bảng tổng hợp các thông số của nọc rắn ở dạng nước theo thời gian 36
Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi giá trị LD
50
của nọc rắn dạng nước . 37
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi theo thời gian về hàm lượng protein của nọc
rắn dạng nước . 38
Hình 3.4. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng nước ở 4
0
C theo thời gianError! Bookmark n
Hình 3.5. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng nước ở -20
0
C theo thời gian 40
Hình 3.6. Bảng tổng hợp các thông số của nọc rắn dạng glycerol theo thời gian . 41
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi giá trị LD50 của nọc rắn ở dạng glycerol 42
Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện hàm lượng protein sau khi bảo quản của nọc rắn dạng
glycerol 43
Hình 3.9. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng glycerol 4
O
C theo thời gian bảo
quản . 44
Hình 3.10. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng glycerol -20
0
C theo thời gian bảo
quản . 46
Hình 3.11. Bảng tổng hợp hàm lượng protein và giá trị 1LD50 của nọc rắn ở dạng
đông khô 46
Hình.3.12. Biểu đồ biểu diễn giá trị LD50 của nọc rắn ở dạng đông khô 47
Hình 3.13. biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein của nọc rắn ở dạng đông khô . 48
Hình 3.14. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng đông khô 4
O
C theo thời gian . 49
v
Hình 3.15. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng đông khô -20
O
C theo thời gian
bảo quản . 50
Hình 3.16. Bảng tổng hợp thời hạn bảo quản của nọc rắn ở các dạng bảo quản . 51
2.Dạng bảo quản tối ưu . 51
Hình 3.17. Sơ đồ biểu diễn thời hạn bảo quản của nọc rắn ở các dạng bảo quản theo
thứ tự tăng dần 52
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Bảng thăm dò giá trị LD
50
của dung dịch nọc rắn mẹ 30
Bảng 2.2: Bảng nồng độ pha tiêm của dung dịch nọc rắn 30
Bảng 3.1: Bảng tổng hợp các thông số của nọc rắn ở dạng nước theo thời gian 36
Bảng 3.2: Bảng tổng hợp các thông số của nọc rắn dạng glycerol theo thời gian 41
Bảng 3.3: Bảng tổng hợp hàm lượng protein và giá trị 1LD50 của nọc rắn ở dạng
đông khô 46
Bảng 3.4: Bảng tổng hợp thời hạn bảo quản của nọc rắn ở các dạng bảo quản 51
vii
1
PHẦN MỞ ĐẦU
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rắn độc cắn là một tainạnnguy hiểm (đặc biệt ở nông thôn và miền núi)
nhiều khi dẫn đến tử vong hoặc tàn phế. Có nhiều loại rắn, đặc điểm gây bệnh
không những khác nhau giữa các loài rắn, mà ngay trong cùng một loài, đặc điểm
này cũng khác nhau tuỳ từng địa phương, nên cách xử lýcũng có những đòi hỏi
khác nhau.
Việt Namlà nước ở vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu quanh năm nóng và ẩm
nên rất phù hợp cho các loài rắn độc phát triển. Vì thế tỉ lệ tử vong do rắn độc cắn
chiếm tỉ lệ khá cao. Tuy chưa có thống kê cụ thể nhưng con số nạn nhân do rắn độc
cắn lên đến con số 30.000 trường hợp mỗi năm (Cassian Bon và cộng sự công bố tại
bệnh viện Chợ Rẫy vào tháng 12/1998). Tại khoa Hồisức cấp cứu bệnh viện Bạch
Mai –Hà Nội, tỷ lệ tử vong do rắn hổcắn trong những năm 1987 –1991 là
20%, thời gian 1991 –1993 là 11,9% (trong tổng số 71 bệnh nhân), thời gian tháng
1 đến tháng 10/1998 là 7% (86 bệnh nhân), không có tử vong do rắn lục cắn.
Hàng năm trên thế giới có khoảng 30.000 đến 40.000 người bị rắn độc cắn,
trong đó số người bị tử vong khoảng 2.000 người [8].
Một nghiên cứu mới được công bố trên tạp chí Public Library of Science
Medicine tại Mỹ cho rằng mỗi năm trên thế giới có khoảng 421.000 người bị rắn
cắn và số người chết lên tới 20.000 người, phần lớn tại Nam Á, Đông Nam Á và
vùng Hạ Sahara của châu Phi. Nghiên cứu này đã rà soátthông tin trên 3.256 bài
báo tại 68 nước. Tuy nhiên, một nghiên cứu khác của các nhà khoa học thuộc Đại
học Kelaniya tại Sri Lanka cho rằng số người bị rắn cắn mỗi năm trên thế giới có
thể dao động từ 1,2 triệu người đến 5,5 triệu người, ước đoán số trungbình là
khoảng 1.841.000 người và con số tử vong có thể lên đến 94.000 người. Các nhà
khoa học đồng ý rằng có một số nạn nhân khá lớn không đến bệnh viện, thích được
2
chữa trị theo cách truyền thống và nhiều người chết tại nhà. Do đó, rất khó thống kê
con số chính xác [9].
Trong nhiều trường hợp, nạn nhân may mắn sống sót vẫn thường mang nhiều
biến chứng, thương tật suốt đời như lở loét,suy thận, xuất huyết nội sọ hoặc phải
cắt cụt chi, mất hết khả năng lao động do ảnh hưởng của hiệu ứng gây rối loạn chức
năng thần kinh của nọc độc [5].
Ở các nước tiên tiến trên thế giới đã sử dụng kháng huyết thanh nọc rắn để
điều trị, cấp cứu cho những ca bị rắn độc cắn. Phương pháp này được cho làđiều trị
hiệu quả nhất .Tại hội nghị về rắn độc và điều trị nạn nhân do rắn độc cắn của Tổ
Chức Y Tế Thế Giới tổ chức tại Geneve từ ngày 6 đến ngày 11 tháng 3 năm 1967
bàn về sản xuất kiểm định huyết thanh trị rắn cắn đã khuyến cáo các nước trên thế
giới hãy tự mình sản xuất huyết thanh để điều trị cho các nạn nhân bị rắn cắn ở
nước mình [1].
Tính đến năm 2003, đã có 50 quốc gia trên thế giới nghiên cứu và đưa vào
sản xuất 185 loại huyết thanh kháng nọc rắn như Philippines, Thái Lan, Malaysia,
Ấn Độ . có riêng hẳn một viện nghiên cứu và sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn.
Năm 2002, hội nghị các chuyên gia hàng đầu thế giới về huyết thanh kháng
nọc rắn tại Anh đã khẳng định: “Mỗi nước cần sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn
theo chuẩn định của chính quốc gia mình”.
Ở Việt Namtừ hơn 100 năm trước, bác sĩ Calmette đã là người đầu tiên phát
minh ra huyết thanh kháng nọc rắnhổ đất ngay tại Viện Pasteur Sài Gòn. Đến năm
1990, đơn vị nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắntrực thuộc Bệnh viện
Chợ Rẫy được thành lập và năm 1998, Bộ Y tế cho phép sử dụng 2 loại huyết thanh
kháng nọc rắnhổ đất và choàm quạp trong điều trị lâm sàng, cấp cứu bệnh nhân bị
rắn cắn tại Bệnh viện Chợ Rẫy. Thế nhưng, với 9 loại rắn độc như đã nói ở trên, đặc
biệt là với mức độ độc hại của rắn hổ chúa, những công trình khoa học nói trên là
3
chưa đủ. Các bệnhnhân đang rất cần loại huyết thanh kháng nọc rắnnày. Nhằm hỗ
trợ các nhà khoa học nghiêncứu chế tạo các loại huyết thanh kháng nọc rắnkhác
phục vụ điều tri, Sở Khoa học và Công nghệ TPHCM đã cấp kinh phí triển khai đề
tài “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật chế tạo huyết thanh kháng nọc rắnhổ
chúa (King Cobra Antivenom)”từ tháng 6 –2001 đến tháng 12 –2012 do TS –BS
Trịnh Xuân Kiếm làm chủ nhiệm đề tài và Đại học Y Dược TPHCM là đơn vị chủ
trì. Đề tài đã đạt được nhiều kết quảthành công, để từ đónhóm nghiên cứu tiếp tục
thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển sản xuất và ứng dụng lâm sàng đa trung tâm
nhằm xác định tính an toàn và hiệu lực huyết thanh kháng nọc rắnhổ chúa”từ tháng
12 –2004 đến tháng 7 –2007 do TS –BS Trịnh Xuân Kiếm, TS – BS Trần Thúy
Hạnh đồng chủ nhiệm đề tài và đơn vị chủ trì là Bệnh viện Bạch Mai –Hà Nội.
Nhóm nghiên cứu đã thử lâm sàng huyết thanh kháng nọc rắnhổ chúa tại 2 cơ sở y
tế lớn nhất nước là Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Chợ Rẫy. Kết quả trên 40
bệnh nhân bị rắn hổ chúa cắn, nhiễm độc nặng, sau khi sử dụng huyết thanh kháng
nọc rắnhổ chúa đã hồi phục hoàn toàn trong 24 giờ đầu. Phản ứng không mong
muốn trong giới hạn cho phép 10% -18%. Kết quả trên đã chứng minh tính an toàn
và hiệu lực của huyết thanhkháng nọc rắnhổ chúa được chế tạo tại Trung tâm
Chống độc quốc gia, Bệnh viện Bạch Mai. Với những kết quả này, rắn hổ chúa Việt
Nam từ nay đã có những “khắctinh” thực sự [10].
Đầu tháng 4/2004, Bộ Y tế đã có văn bản cho phép Viện VắcXin Nha Trang
sản xuất hai loại huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và rắn lục tre.
Huyết thanh kháng nọc rắn đang được ứng dụng rộng rãi và có một ý nghĩa
về mặt nhân đạo. Để đảm bảo chất lượng huyết thanh,nọc rắn dùng làm kháng
nguyên gây miễn dịch yêu cầu phải bảo toàn đượccác thành phần đặc trưng theo
thời gian. Vì thế, vấn đề đặt ra là phải có phương pháp bảo quản tốt để đảm bảo chất
lượng kháng nguyên nọc rắn để phục vụ cho việc sản xuất huyết thanh kháng nọc
rắn và công tác nghiên cứu.
4
Chính vì vậy, em thực hiện nghiên cứu đề tài: “Đánh giá các dạng bảo quản
kháng nguyên nọc rắn”
Mục đích đề tài: ► Chọn dạng bảo quản kháng nguyên nọc rắn tốiưu
► Xác định hạn bảo quản của kháng nguyên.
5
CHƯƠNG I TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ RẮN
Việt Namlà nước ở vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu quanh năm nóng và ẩm,
có hơn 3.200km bờ biển và 2/3 diện tích đất đai là rừng núinên rất đa dạng sinh
học. Do đó, động vật hoang dã nói chung và rắn nói riêng rất dễ phát triển.
Rắn có thể sống khắp mọi nơi từ những vùngnúi cao, vùng đồng bằng đến
các nơi hải đảo. Chúng sống trên cây,trên mặt đất,trong hang hốc, ở các suối, ao hồ
và biển cả.
Các loài rắn độc của Việt Nam không chỉ phổ biến trong việc sử dụng làm
thuốc cổ truyền mà còn được coi là nhóm bò sát có tính đadạng về thành phần loài.
Cho đến nay Việt Nam hiện biết là nơi cư ngụ của 193 loài rắn thuộc 69 giống, 8
họ. Trong số đó ghi nhận tổng số 53 loài rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ
Rắn hổ Elapidaevà 18 loài (8 giống) thuộc họ Rắn lục Viperidae. Bên cạnh đó, sự
phân bố theo vùng địa lý của các loài rắn độc cũng khác nhau: 12 loài chỉ ghi nhận
ở miền Bắc, 19 loài chỉ ghi nhận ở miền Nam và 22 loài ghi nhận ở cả hai miền đất
nước. Có 5 loài hiện được coi là đặc hữu của Việt Nam gồm: Rắn cạp nia s-lo-win-s-ki Bungarus slowinskii, Đẻn xanh lơ Hydrophis parviceps, Rắn lục hòn sơn
Cryptelytrops honsonensis, Rắn lục trùng khánh Protobothrops trungkhanhensis và
Rắn lục trường sơn Viridovipera truongsonensis. Đáng chú ý là sau công bố của
Wuesteretal (1995), loài Rắn hổ mang trước đây có tên là Naja najahiện đã được
tách thành 3 loài riêng biệt: Loài rắn hổ mang trung quốc N.atraphân bố ở miền
Bắc, hai loài Rắn hổ mang một mắt kính N. kouthiavà Rắn hổ mang xiêm N.
siamensisghi nhận ở miền Nam. Chưa có đánh giá chi tiết nào về việc sử dụng các
loài rắn ở Việt Nam, tuy nhiên, rắn được thu thập để làm thực phẩm, lấy nọc độc,
làm thuốc cổ truyền và dùng trong kỹ nghệ da. Các loài rắn độc phổ biến dùng
ngâm rượu là các loài rắn cạp nia (Bungarus spp.), rắn hổ mang(Najaspp.), và Hổ
chúa Ophiophagus hannah. Rắn biển đôi khi được dùng ngâm rượu nhưng chúng
6
thường được dùng để làm thực phẩm ở các khu vực ven biển. Do việc nuôi giữ rắn
độc để làm cảnh có thể gây nguy hiểm với con người nhưng một số loài có màu sắc
đẹp, có khả năng nuôi làm cảnh như: Rắn lá khô đầu hình V Sinomicrurus kellogi,
Rắn lá khô thường S. macclellandi, Rắn lục đầu bạc Azemiops feae [16].
Theo GS. Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng (Viện tài nguyên sinh vật quốc
gia) ở nước ta có 2 loại rắn độc[2]:
■ Rắn sống trên cạn gồm 3 họ:
▪Họ rắn hổ (Elapidae) có 4 loài: rắn cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn cạp
nia (Bungarus candidus), rắn hổ mang(Naja naja), rắn hổ chúa (Ophigophagus
hanah).
▪Họ rắn lục (Viperidae).
▪Họ rắn có hố má (Crotalidae) gồm có rắnchàm quạp (Agkistrodon
rhodostoma), rắn lục núi (Timeresurus popeorum).
■ Rắn độc ở biển (Hydrophiidae): Có 13 loại rắn biển (đẻn biển), tất cả đều
là loại rắn độc và hầu hết đều có nọc độc thần kinh, gây liệt trung khu hô hấp.
1.1.1. Đặc điểm cơ bản về rắn
Rắn thuộc bộ phụ rắn (Serpentis) trong bộ có vảy (Squamata), lớp bò sát
(Reptilia) thuộc ngành động vật có xương sống (Chordata). Rắn là động vật bò sát
có cơ thể dài, không chân,toàn thân phủ một lớp vảy khô, mi mắt trong suốt và
thường xuyên đóng kín được gọi là vảy mắt. Rắn là động vật máu lạnh, có thân
nhiệt thay đổi theo môi trường. Cơ thể của rắn được chia làm đầu, thân và đuôi. Đầu
và thân khó phân biệt rõ ràng ngoại trừ trường hợp rắn lục có đầu tam giác. Hậu
môn nằm ở phần bụng đượcphủ một lớp vảy (vảy hậu môn) vảy này là ranh giới
giữa thân và đuôi. Chiều dài của thân làkhoảng cách từ mõm đến hậu môn, phần


TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng việt
1. Nguyễn Thị Kê và cộng sự (1998), Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản
xuất huyết thanh nọc rắn hổ mang, kháng huyết thanh nọc rắn cạp nong và
kháng huyết thanh kháng nọc rắn lục tinh chế,Đề tài nghiên cứu, Viện
Vắc-Xin và các chế phẩm sinh học.
2. Trần Kiên –Nguyễn Quốc Thắng (1980), Các loài rắn độc ở Việt Nam,
NXB khoa học kỹ thuật –Hà Nội.
3. Phòng nghiên cứu và phòng kiểm định –Viện Vắc-Xin và Sinh Phẩm Y
Tế, Sáng kiến cải tiến 2010, “Đông khô kháng nguyên nọc rắn”
II. Tài liệu tiếng anh.
4. Bernard Rees and Alexandrine Bilwes (1993), “ Three –Dimensionnal
Structures of Neurotoxins and Cardiotoxins”, Chemical Research in
toxicologyVol.6.N.4, American Chemical Society
57
5. Rutai Raweerith and Kavi Ratanabanangkoon (2005), Immunochemical
and biochemical comparisons of equine monovalent and polyvalent snake
antivenoms, toxicon45, pp.369 –375.
III. Tài liệu internet
6. http://www.webluanvan.com/f31/qua-trinh-say-thang-hoa-36924/
7. http://violet.vn/ngoclett1/entry/show/entry_id/4265007
8. http://www.bvdkdongthap.vn/hien_thi_nd.php?ma_noi_dung=77&ma_linh
_vuc=6&ma_the_loai=11
9. http://vietbao.vn/Suc-khoe/Nhieu-nguoi-chet-vi-ran-can/62245688/248/
10. http://www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/suc-khoe/16825_Huyet-thanh-khang-noc-ran-ho-chua.aspx
11. http://en.wikipedia.org/wiki/Snake
12. http://www.yhoccotruyen.htmedsoft.com/duochoc/caythuoc/BACHHOAX
A.htm
13. http://www.nhidong.org.vn/Default.aspx?sid=7&nid=958
14. http://nhakhoavietduc.com.vn/xem-tin-tuc/phai-lam-gi-khi-bi-ran-doc-can.html
15. http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=4283
16. http://www.vnmn.ac.vn/index.php/193/372/%C4%90A_D%E1%BA%A0N
G_C%C3%81C_LO%C3%80I_R%E1%BA%AEN_%C4%90%E1%BB%
98C_%E1%BB%9E_VI%E1%BB%86T_NAM