Luận Văn Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên

Khóa luận tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu tươi


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG . v
DANH MỤC CÁC HÌNH .vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1.1. Vi khuẩn lactic .3
1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 3
1.1.2. Phân loại lactic .3
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic .5
1.1.4.Vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 6
1.2. Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò .8
1.2.1. Đặc điểm chung về cá giò .8
1.2.2. Các phương pháp bảo quản cá giò .9
1.3. Tình hình nghiên cứu về sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic
trong thực phẩm . 14
1.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 14
1.3.2.Những nghiên cứu trong nước . 16
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 18
2.1. Vật liệu 18
2.1.1. Vi sinh vật . 18
iii
2.1.2. Nguyên liệu cá giò 19
2.1.3. Hóa chất và môi trường 19
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 21
2.2.1. Xác định khả năng sinh trưởng . 21
2.2.2. Xác định hoạt tính sinh bacteriocin . 22
2.2.3. Thí nghiệm nhúng da cá giò trong dịch tế bào vi khuẩn lactic . 22
2.2.4. Thí nghiệm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi nguyên con bằng dịch tế bào vi
khuẩn lactic kết hợp bảo quản lạnh . 24
2.2.5. Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí . 24
2.2.6. Xác định tổng vi khuẩn lactic 26
Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 27
3.1. Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8 . 27
3.1. Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi . 31
3.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò nguyên liệu tươi . 33
3.4. Tổng số vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con . 36
3.5. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con . 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
iv
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Stt Ký hiệu Nghĩa
1 CFU
Colony forming unit
(Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
2 LAB Lactic acid bacteria
(Vi khuẩn lactic)
3 MRS
de Man, Rogosa and Shatpe
(Môi trường nuôi cấy LactoBacillus)
4 PCA Plate Count Agar
(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số)
5 OD Optical Density
(Mật độ quang)
6 TSA Trypton soy agar
(Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số)
7 TSB Trypton soy broth
(Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số)
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Thành phần môi trường MRS . 20
Bảng 2. Thành phần môi trường TSB 20
Bảng 3. Khả năng sinh trưởng, đường kính vòng kháng khuẩn, hoạt độ riêng của
chủng T8 trên môi trường MRS . 29
Bảng 4. Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò . 31
Bảng 5. Sự phát triển tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò 33
Bảng 6. Tổng vi khuẩn lactic trên cágiò nguyên liệu tươi nguyên con 36
Bảng 7. Khả năng sinh bacteriocin của tổng vi khuẩn lactic . 36
Bảng 8. Tổng vi khuẩn hiếu khítrên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 42
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Vi khuẩn lactic T8 nuôi trên môi trường MRS sau 48 giờ ở nhiệt độ 37
0
C.
18
Hình 2. Vi khuẩn Bacillustrên môi trường TSA sau 24 giờ nuôi ở nhiệt độ 37
0
C 19
Hình 3. Cá giò nguyên liệu tươi 19
Hình 4. Mặt ngoài da cá . 23
Hình 5. Mặt trong da cá . 23
Hình 6. Mẫu 1: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 cho vào túi PE . 23
Hình 7. Mẫu 2: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic không cho vào túi PE 24
Hình 8. Mẫu 3: Mẫu đối chứng 24
Hình 9. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 6 -18
giờ nuôi . 27
Hình 10. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với BacillusB1.1 sau 15 -19 giờ nuôi 28
Hình 11. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với BacillusB1.1 sau 12 -24 giờ nuôi 28
Hình 12. Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với BacillusB1.1 sau 12 -27 giờ nuôi 29
Hình 13. Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8
30
Hình 14. Vi khuẩn lactic trên môi trường thạch MRS, nuôi ở nhiệt độ 37
0
C sau 48
giờ nuôi cấy . 31
Hình 15. Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò . 32
Hình 16. Sự phát triển tổng vi sinh vật hiếu khí trên da cá giò . 33
Hình 17. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên môi trường PCA sau 48 giờ 34
Hình 18. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con . 36
Hình 19. Khả năng sinh trưởng vàsinh bacteriocin của vi khuẩn lactic ở mẫu 1 . 37
Hình 20. Khả năng kháng Bacilluscủa vi khuẩn lactic T8 theo thời gian bảo quản 3
ngày, 5 ngày, 7 ngày 37
vii
Hình 21. Vi khuẩn lactic T8 sau 3 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng
dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 39
Hình 22. Vi khuẩn lactic T8 sau 5 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng
dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 . 40
Hình 23. Vi khuẩn lactic T8 sau 7 ngày bảo quản ở mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 40
Hình 24. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con . 41
Hình 25. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 0 ngày . 43
Hình 26. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 3 ngày . 44
Hình 27. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 5 ngày . 45
Hình 28. Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn
lactic T8 lúc 5 ngày và 7 ngày . 46
1
LỜI MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản thủy sản trước kia vốn chỉ góp phần nhỏ bé trong
tổng sản lượngthủy sảntoàn cầu,tuy nhiêntừ những năm 1950 đến năm 2008 đã
tăng 50 lần và hiện nay chiếm gần 50% trong tổng sản lượng sản xuất trên toàn
thế giới. Ở Việt Nam, diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng: năm 2004
đạt 1,4 triệu tấn, chiếm 68% tổng sản lượng thủy sản, năm 2010 sản lượng thủy
sản đạt2706,8 nghìn tấn bằng 105,4% so với cùng kỳ năm 2009 và 102,1% so
với kế hoạch năm 2010. Kỳ vọng năm 2011, theo kế hoạch nghành thủy sản phấn
đấu mức tăng trưởng chung là 7% so với năm 2010. Tổng sản lượng năm 2011
phấn đấu đạt khoảng 5,3 triệu tấn, trongđó khai thác là 2,3 triệu tấn và nuôi
trồng là 3 triệu tấn. Mặc dù, nghành nuôi trồng đạt được nhiều kết quả nhưng nó
đang đối mặt với những thách thức về môi trường nuôi, dịch bệnh, công nghệ sau
thu hoạch
Nguyên liệu thủy sản nói chung là loại nguyên liệu dễ bị hư hỏng nếu
không được bảo quản hợp lý. Hiện nay, các loại nguyên liệu sau đánh bắt và thu
hoạch của người dân chủ yếu bảo quản bằng phương pháp ướp đá lạnh. Ngoài ra,
để giữ nguyên liệu thủy sản tươi lâu người dân sử dụng các loại hóa chất độc hại
như ure, borit, nitrat, hàn the, chất kháng sinhđể bảo quản. Những chất bảo quản
này nếu sử dụng không hợp lý sẽ gây nên tình trạng mất an toàn thực phẩm, ảnh
hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng. Do đó, việc sử dụng hóa chất
để bảo quản nguyên liệu ít được sử dụng và một số chất bảo quản độc hại bị cấm.
Yêu cầu đặt ra phải tìm được phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn và kinh
tế. Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu thay thế những chất
bảo quản hóa học bằng phương phápsinh học an toàn hơn cho người sử dụng và
người tiêu dùng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh
vật mang những đặc tính: ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi sinh vật gây hư
hỏng, gây thối nguyên liệu, an toàn cho người tiêu dùng. Một trong những nhóm
vi khuẩn có những đặc tính này là vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic được công
nhận là an toàn để sử dụng, nó được sử dụng trong quá trình bảo quản như lên
2
men dưa chua, nem chua, sữa chua vì trong quá trình sống vi khuẩn lactic ngoài
việc sinh bacteriocin còn sinh acid lactic là tác nhân ức chế nhiều vi sinh vật.
Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King
fish) là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao nên nó được nuôi phổ biến trong lồng
bè ở các vùng biển tại các địa phương như: Hải Phòng, Nghệ An, Quảng Ninh,
Vũng Tàu, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Kiên Giang. Hiện nay, cá giò được tiêu
thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi
hoặc chế biến đông lạnh. Trên thị trường, sự chênh lệch giữa cá giò tươi và cá
giò ươn lớn có thể tới 60.000đ/kg. Do đó việc nghiên cứu bảo quản cá giò có ý
nghĩa kinh tế cao.
Sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với các
điều kiện bên ngoài, môi trường nuôi cấy. Đa số mỗisinh vật có môi trường nuôi
cấy đặc hiệu, MRS là môi trường nuôicấy vi khuẩn lactic nói chung, ở đó vi
khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển tốt nhưng khi ứng dụng vi khuẩn này bảo
quản nguyên liệu thủy sản như cá giò thì sao?
Để trả lời cho câu hỏi đó chúng tôi tiến hành đề tài “Đặc điểm sinh trưởng của vi
khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu
tươi”.
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định khả năngsinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
trên môi trường MRS.
- Xác định khả năng sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic sinh
bacteriocin trên môi trường MRS.
- Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
trên cá giò nguyên liệu tươi.
3
Chương I.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩnlactic
1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, bất động, không sinh bào
tử, có khả năng lên men đường thành acid lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp
chung vào họ Lactobacteriaccae. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác
nhau như: trực khuẩn hoặc cầu khuẩn. Cầu khuẩn xếp các giống Streptococcusvà
Leuconostoc, còn trực khuẩn thành một giống Lactobacillus. MRS là môi trường để
phân lập và nuôi cấy chủng lactic. Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong
bóng, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, đôi khi khuẩn lạc có
màu trắng đục, tròn lồi. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid.
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵkhí, vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic có nhu cầu
về chất dinh dưỡng phức tạp, không một đại diện nào của nhóm này có thể phát
triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose. Đa số chúng cần
các loại vitamin như: Lactoflavin, tiamin, pantotenic acid, folic acid, và các
amino acid Các vi khuẩnlacticlên men được đườngmonno và disaccharide
nhưng không lên men được tinh bột và các polysaccharide khác, ngoại trừ
L.delbrueckiinđồng hóa được tinh bột. Đa số vi khuẩn lên men lactic dị hình có
khả năng sử dụng pentose và acidcitric, một số có hoạt tính protease (Lương
ĐứcPhẩm, 2002).
1.1.2.Phân loại lactic
Dựa vào khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, người ta
chia thành hai nhóm vi khuẩn lactic: vikhuẩn lactic dị hình và vi khuẩn lactic
đồng hình.
 Vi khuẩn lacticlên menđồng hình
Vi khuẩn lactic đồng hình là những vi khuẩn trong tế bào của chúng chứa
enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Khi lên men các loại đường
chúng sinh ra chủ yếu là acid lactic.Vi khuẩn lactic lên men đồng hình như:
Streptococcus thermophilus, Lactobacillusbulgaricus, Lactobacilluscasein,
Lactobacillusacidophilus, Lactobacillusplantarum .
4
Một số vi khuẩn lactic điển hình:
Streptococcus lactic -cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết
song đôi hoặc thành chuỗi ngắn. Giống này ưa ấm, phát triển tốt ở 30 -35
0
C, làm
đông tụ sữa sau 10 -12 giờ. Trong môi trường nó tích tụ được 0,8 - 1% acid.
Nhiệt độ tối thiểu cho phát triển là 10
0
C, tối đa là 40 -45
0
C. Một số chủng tạo
thành bacteriocin ở dạng nizin.
Steptococcus lactic -liên cầu khuẩn lacitic được sử dụng rộng rãi trong
chế biến các sản phẩn sữa như sữa chua, crem -bơ chua, phomat .Khi đông tụ
sữa các cục vón chặt và nhẵn được tạo thành.
Streptococcus cremoris -tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và
tạo acid trong môi trường. Nhiệt độ thíchhợp cho sự phát triển là 25
0
C, tối thiểu
là 10
0
C, tối đa là 36 -38
0
C. Khi sử dụng phải phối trộn với Str. lactic. Một số
chủng thuộc giống Diplococussinh bacterioxin ở dạng diplocoxin (Lương Đức
Phẩm, 2002).
 Vi khuẩn lactic lên men dị hình
Vi khuẩn lactic lên men dị hình là vi khuẩn khi lên men các loại đường
chúng không chỉ tạo ra acid lactic mà còn tạo ra các sản phẩm khác như acid
acetic, acid propionic, ethanol .Vi khẩn lactic dị hình như: Lactobacillus
pasterianus, Lactobacillusbrevis, Lactobacilluslycopessici, Streptococcus
cumoris, Streptococcus lactic .
Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình điển hình:
Lactobacillusbrevis (tên cũ là L. brassica fermeentati) tìm thấy chủ yếu
trong muối chua cải bắp, rau cải, dưa chuột. Vì vậy nó được gọi là trực khuẩn cải
bắp. Trong lên men, ngoài acid lactic nó còn tạo ra acid axetic, rượu etylic và
CO2
, nó còn tạo cho sản phẩm có hương thơm dễ chụi.
Lactobacilluslycopersici - trực khuẩn sinh hơi, đứng riêng lẻ hoặc liên kết
thành chuỗi, gây hư hỏng cà chua (thối nhũn cuống) cũng như cà chua đóng hộp,
nước cà chua thanh trùng chưa triệt để. Ngày nay, giống này được coi như là biến
chủng của L.brevis.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
 Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ thủy sản(2004), “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm thủy sản,
dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản”, NXB nông nghiệp Hà
Nội, 296 tr.
2. Đặng Phương Nga,Vương Thị Nga, Phạm Thị Hằng, Lại Thúy Hiền
(2006), “Khả năng đối kháng vibriotrong nước nuôi tôm của một số chủng
vi khuẩn lựa chọn”. Tạp chí Công nghệ sinh học 4(3): 379 -387.
3. Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên, Đỗ Thu Phương, Nguyễn Bá Tú,
Lại Thúy Hiền(2007), “Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibriotrong
nước tôm của Bacillus subtilisHY1 và Lactococcus lacticCC4K”. Tạp chí
Công nghệ sinh học 5(3): 383 -390.
4. Lương Đức Phẩm(2002), “Vi sinh vật và bảo quản thực phẩm”, NXB
nông nghiệp Hà Nội.
5. Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An(2008), “Thu nhận
Bacteriocin bằng phương pháp len men bởi tế bào Lactococcuslactic cố
định trên chất mang Cellulose vi khuẩn và ứng ứng dụng trong bảo quản
thịt tươi sơ chế tối thiểu”, Tạp chí Phát triển khoa học và công nghệ -ĐHQG TP.HCM, 11(9):100 -108.
6. Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Đỗ Minh Phụng và Nguyễn AnhTuấn
(2006), “Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản tập 1, Nguyên liệu chế
biến thủy sản”, NXB nông nghiệpTp. Hồ Chí Minh, 252tr.
7. Trần Linh Thước(2008), “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,
thực phẩm và mỹ phẩm”, NXB Giáo dục, Tp. Hồ Chí Minh, 232 tr.
 Tài liệu tiếng Anh
8. Gao Y, JiaS, Gao Qand Tan Zh (2010), A novel bacteriocin with a
broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2 isolated from
traditional Chinese fermented cabbage. Food Control,1(21): 76 -81.
49
9. GálvezA, AbriouelH, LópezRL, Omar NB (2007). Bacteriocin -based
strategies for food biopreservation. International Journal of Food
Microbiology, 120(1 - 2): 51 - 70.
10. Ge J, Ping W, Song G, Du C, Ling H, Sun X, Gao Y (2009), Paracin 1.7,
a bacteriocin produced by Lactobacillus paracaseiHD 1.7 isolated from
Chinese cabbage sauerkraut, a traditional Chinese fermented vegetable
food. Wei Sheng Wu Xue Bao, 49(5): 16 -609.
11. Godic TK and Bogovic BM (2003). Bacteriocin produced by B.cereus
from milk. Food technol. Biotachnol, 41(2): 121 -129.
12. Shewan JM (1962), The bacteriology of fresh and spoiling fish and some
related chemical changes. In recent advances in food science, 1: 63 –197.
13. ToméE, PereiaVL, LopesCI, GibbsPA, Teixeira PC (2008), In vitro
tets suitability of bacteriocin -producing lactic acid bacteria, as potential
biopreservation cultures in vacuum -packaged cold -smoked salmon.
Food Control, 19(5):535 -543.
14. Zhang J, Lui G, Li P, Qu Y (2010), Pentocin 31-1, a novel -meat -borne
bacteriocin and its applicationas biopreservation in chill - stored tray
packaged pork meat. Food Control, 2 (21):198 -202.