Thạc Sĩ đặc điểm các gen mã hóa β-lactamase phổ mở rộng ở một số vi khuẩn gram âm và nguy cơ lan truyền qua

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm trùng cao so với thế giới, trong đó những vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, . là những tác nhân phổ biến gây ra các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm ở người. Việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát tốt hiện nay đã làm cho tình hình vi khuẩn đề kháng kháng sinh ngày một gia tăng [1],[3], [34]. Theo đó, một số chủng vi khuẩn Gram âm ở Việt Nam đã đề kháng ngày một mạnh hơn với cephalosporin thế hệ thứ 3 và cả với fluoroquinolon, là những kháng sinh thông dụng trong điều trị những bệnh do các vi khuẩn này gây ra. Điều này gây khó khăn cho vấn đề trị liệu, tăng chi phí đồng thời tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân [2],[4],[6], [34],[21],[25].
Việc sử dụng rộng rãi kháng sinh nhóm cepholosporin phổ rộng trên lâm sàng dẫn đến sự đề kháng của vi khuẩn qua cơ chế tiết enzym beta – lactamase phổ rộng (Extended Spectrum Beta-Lactamase – ESBL) ngày càng gia tăng [39]. ESBL là enzym có khả năng ly giải các kháng sinh thuộc họ beta-lactam, chủ yếu là các cephalosporin phổ rộng, penicillin và aztreonam [29], [12], [24]. Các vi khuẩn tiết ESBL cũng thường đa đề kháng với các nhóm kháng sinh khác như aminoglycosid, fluoroquinolon, tetracyclin, chloramphenicol, và sulfamethoxazole – trimethoprim [34],[36],[37]. Vi khuẩn tiết ESBL thực sự là gánh nặng trong điều trị nhiễm khuẩn khi mà tần suất và tỷ lệ tử vong trên các bệnh cảnh nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn này ngày càng gia tăng [8],[15],[16],[40]. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã mô tả các gen chịu trách nhiệm cho sự tiết ESBL, đồng thời cũng chứng minh được plasmid đóng vai trò quan trọng trong việc lan truyền những gen này. Phần lớn các gen mã hóa ESBL nằm trên các plasmid có kích thước khác nhau và có khả năng tiếp hợp cao. Các plasmid kích thước lớn (hơn 50 kb) mang gen mã hóa ESBL cũng thường mang các gen đề kháng với các kháng sinh khác [9],[32]. Tại Việt Nam có rất ít các nghiên cứu về cơ chế đề kháng cephalosporin cũng như cơ chế lan truyền các gen đề kháng này ở các vi khuẩn Gram âm. Trước tình hình đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu:
- Khảo sát đặc điểm các gen mã hóa enzym ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram lâm phân lập từ bệnh phẩm tại bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất thành phố Hồ Chí Minh.
- Đánh giá nguy cơ lan truyền các gen mã hóa ESBL này qua trung gian plasmid.

MỤC LỤC

ACKNOWLEDGEMENTS . i
LỜI CÁM ƠN ii
MỤC LỤC . v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . viii
DANH MỤC CÁC BẢNG x
DANH MỤC CÁC HÌNH xi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ xii
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1. TỔNG QUAN . 3
1.1 Tổng quan về họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) . 4
1.1.1 Escherichia coli (E. coli) . 4
1.1.2 Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) 5
1.2 Tổng quan về họ kháng sinh β -lactam . 6
1.2.1 Kháng sinh họ β-lactam và cơ chế hoạt động . 6
1.2.2 Cơ chế đề kháng β-lactam ở vi khuẩn . 7
1.2.3 Phân loại β-lactam 8
1.3 Enzym β -lactamase 9
1.3.1 Định nghĩa . 9
1.3.2 Phân loại 9
1.4 Enzym β -lactamase phổ mở rộng (ESBL) . 11
1.4.1 Định nghĩa . 11
1.4.2 Phân loại 11
vi
1.4.3 Phương pháp phát hiện kiểu hình ESBL . 18
1.4.4 Phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen ESBL . 19
1.5 Plasmid 20
1.6 Tình hình dịch tễ học của các vi khuẩn sinh ESBL. . 20
1.6.1 Tình hình trên thế giới. . 20
1.6.2 Tình hình Việt Nam 22
1.7 Dịch tễ học phân tử và sự phát tán các loại ESBL 23
1.7.1 Tình hình trên thế giới 23
1.7.2 Tình hình Việt Nam 24
Chương 2. VẬT LIỆU và PHƯƠNG PHÁP 26
2.1 Chủng vi khuẩn . 27
2.2 Định danh họ vi khuẩn Enterobacteriacae 29
2.3 Xác định kiểu hình ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi . 29
2.3.1 Nguyên tắc 29
2.3.2 Thực hiện 30
2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) các chủng sinh ESBL . 30
2.5 Chiết DNA từ tế bào vi khuẩn 31
2.5.1 Tách chiết DNA bộ gen của vi khuẩn . 31
2.5.2 Tách chiết plasmid theo phương pháp của Kadou – Liu [25]. 31
2.6 Phản ứng khuếch đại DNA xác định gen mã hóa ESBL 32
2.7 Tinh sạch DNA . 33
2.8 Giải trình tự sản phẩm khuếch đại 34
2.9 Thí nghiệm tiếp hợp 35
vii
2.10 Lai DNA bằng phương pháp Southern Blot . 36
2.10.1 Chuyển DNA lên màng . 36
2.10.2 Đánh dấu mẫu dò 37
2.10.3 Lai DNA với mẫu dò 38
2.10.4 Phát hiện sự quang hóa của mẫu dò bởi ECL . 39
Chương 3. KẾT QUẢ và BÀN LUẬN . 41
3.1 Kiểu hình ESBL của các vi khuẩn thử nghiệm . 42
3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 42
3.1.2 Đặc điểm kiểu hình ESBL 42
3.2 Đặc điểm đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn sinh ESBL 43
3.3 Đặc điểm các gen mã hóa ESBL . 45
3.3.1 Phản ứng khuếch đại gen (PCR) . 45
3.3.2 Giải trình tự các gen blaTEM, blaCTX-M-1, blaCTX-M-9 46
3.3.3 Phân tích plasmid của các chủng sinh ESBL 49
3.3.4 Lai Southern Blot xác định vị trí các gen bla trên plasmid 51
3.3.5 Khả năng tiếp hợp của các plasmid mang gen mã hóa ESBL 53
3.4 Bàn luận 55
Chương 4. KẾT LUẬN và ĐỀ NGHỊ . 58
4.1 Kết luận . 59
4.2 Đề nghị 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO . I
PHỤ LỤC . V