Tiến Sĩ Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của

iii



MỤC LỤC
Trang
Lời cảm tạ i
Lời cam đoan . ii
Mục lục iii
Danh sách bảng vii
Danh sách hình . x
Danh mục từ viết tắt . xiii
Tóm tắt . xv
Abstract xvii
Chương 1: Giới thiệu . 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu . 2
1.2.1 Mục tiêu đề tài 2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3
1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận
án . 3
1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học . 4
Chương 2: Tổng quan tài liệu . 5
2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo 5
2.1.1 Đặc điểm của nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo . 5
2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới . 5
2.1.3 Quản lý chất thải chăn nuôi heo tại Việt Nam . 6
2.2 Xử lý nước thải trong chăn nuôi . 7
2.2.1 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước . 7
2.2.2 Biện pháp xử lý nước thải 8
2.3 Kết tụ sinh học trong nước 9
2.3.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant) 9
2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học . 18
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tụ của vi khuẩn 23
2.3.4 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước
thải 29
iv



2.3.5 Quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
trong xử lý nước thải 31
Chương 3: Phương pháp nghiên cứu 33
3.1 Phương tiện nghiên cứu 33
3.1.1 Thời gian . 33
3.1.2 Địa điểm . 33
3.1.3 Vật liệu . 33
3.1.4 Thiết bị 34
3.1.4 Hóa chất 34
3.2 Phương pháp nghiên cứu 35
3.2.1 Chuẩn bị mẫu 35
3.2.2 Phân lập và làm thuần 36
3.2.3 Phân tích và xử lý số liệu . 38
3.3 Nội dung nghiên cứu 38
3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 38
3.3.2 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kế tụ
sinh học . 40
3.3.3 Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng sinh
học phân tử . 41
3.3.4 Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền dựa trên trình tự 16S
rRNA . 46
3.3.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất
kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn . 47
3.3.6 Ly trích chất kết tụ sinh học 53
3.3.7 Thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học . 54
3.7.8 Ứng dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
xử lý nước thải sau biogas . 55
Chương 4: Kết quả và thảo luận . 56
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học . 56
4.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 57
4.2.1 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
protein . 57
4.2.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
polysaccharide 58
v



4.3 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học . 59
4.3.1 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học protein 59
4.3.2 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học polysaccharide 59
4.4 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao ở các tỉnh đồng
bằng sông Cửu Long . 61
4.4.1 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein . 61
4.4.2 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 68
4.5 Phân tích đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học 74
4.5.1 Đa dạng về chủng giữa của các loài vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học dựa vào chỉ số Shannon 76
4.5.2 Đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học . 77
4.6 Xác định các điều kiện tối ưu cho khả năng tổng hợp chất kết
tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P
(protein) và chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S
(polysaccharide) 91
4.6.1 Mối tương quan giữa thời gian nuôi ủ, tỷ lệ kết tụ và mật độ
vi khuẩn 91
4.6.2 Nhiệt độ nuôi ủ . 93
4.6.3 Giá trị pH 94
4.6.4 Sự tương tác giữa các điều kiện nuôi sinh khối về thời gian,
pH và nhiệt độ của hai chủng vi khuẩn 97
4.6.5 Nguồn carbon, nguồn nitrogen và khoáng vô cơ . 101
4.6.6 Xác định ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố dinh dưỡng đến
hiệu quả kết tụ sinh học 102
4.6.7 Ion kim loại bổ sung . 106
4.6.8 Nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung 108
4.6.9 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số vi khuẩn và
tỷ lệ kết tụ của 2 chủng vi khuẩn sau khi tối ưu . 109
4.6.10 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn
protein . 110
vi



4.6.11 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn
polysaccharide 111
4.6.12 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học
cao được chọn thử nghiệm hiệu suất ứng dụng 112
4.7 Ly trích chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ hai chủng vi
khuẩn Bacillus megaterium LA51P và Bacillus aryabhattai
KG12S và thử nghiệm hiệu quả kết tụ sinh học 113
4.7.1 Kết quả ly trích . 113
4.7.2 Hiệu suất kết tụ sinh học 114
4.8 Thử nghiệm hiệu quả xử lý nước thải sau biogas từ trại chăn
nuôi heo 115
4.8.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ (%) các chủng vi khuẩn
khi thử nghiệm ở nước thải ngoài thực tế . 115
4.8.2 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở
thể tích 10 lít . 119
4.8.3 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của 2 chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở
thể tích 100 lít . 121
4.9 Hiệu quả xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 1 m
3
và 40 m
3
122
4.9.1 Hiệu suất xử lý ở thể tích 1 m
3
. 122
4.9.2 Hiệu suất xử lý ở thể tích 40 m
3
. 122
Chương 5: Kết luận và đề xuất . 125
5.1 Kết luận . 125
5.2 Đề xuất 126
Tài liệu tham khảo . 127
Phụ lục 145
vii



DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn
khác nhau từ năm 2007 – 2013 . 16
Bảng 2.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ
sinh học . 19
Bảng 2.3 Một số cặp mồi sử dụng để nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học . 20
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen đến hiệu quả tổng
hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Klebsiella sp. . 26
Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến
hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Serratia
fiacria . 27
Bảng 2.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sự kết tụ của các vi sinh
vật tổng hợp chất kết tụ sinh học 27
Bảng 2.7 Liều lượng của các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
khác nhau cho tỷ lệ kết tụ (%) ở dung dịch kaolin . 29
Bảng 2.8 Ảnh hưởng của liều lượng, nhiệt độ và pH lên khả năng kết
tụ của chất kết tụ M-1 . 29
Bảng 2.9 Kết quả xử lý nước thải tinh bột bởi các nhân tố kết tụ . 30
Bảng 2.10 Hiệu quả xử lý các loại nước thải bởi chất kết tụ sinh học từ
vi khuẩn Serratia ficaria 31
Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu của nước thải tại trại chăn nuôi heo (sau
biogas) ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long . 34
Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 35
Bảng 3.3 Thành phần cho 1 mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR . 42
Bảng 3.4 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 1 . 47
Bảng 3.5 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 2a . 49
Bảng 3.6 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 2b . 49
Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 3 . 50
Bảng 3.8 Nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát sự tương tác 3 yếu tố
thời gian, pH và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi
khuẩn 50
Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 yếu
tố nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ . 51
viii



Bảng 3.10 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ carbon,
nitrogen và khoáng vô cơ . 51
Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải ở
điều kiện phòng thí nghiệm 54
Bảng 4.1 Số mẫu phân lập và số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp
chất kết tụ sinh học 56
Bảng 4.2 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein có
tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL . 59
Bảng 4.3 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide
có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL . 60
Bảng 4.4 Đặc điểm sinh học của 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết
tụ sinh học protein 62
Bảng 4.5 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 18 dòng vi khuẩn với
các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene . 64
Bảng 4.6 Kết quả định danh 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học protein 67
Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học của 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết
tụ sinh học polysaccharide 69
Bảng 4.8 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 16 dòng vi khuẩn so
với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene . 71
Bảng 4.9 Kết quả định danh 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học polysaccharide 73
Bảng 4.10 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học dựa trên cây phả hệ mối quan hệ di truyền 75
Bảng 4.11 Chỉ số đa dạng giữa các loài trong quần thể vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học 76
Bảng 4.12 Chỉ số đa dạng giữa các chủng trong quần thể vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học 77
Bảng 4.13 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học . 83
Bảng 4.14 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn . 85
Bảng 4.15 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai 87
Bảng 4.16 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus
aryabhattai 88
Bảng 4.17 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium . 88
Bảng 4.18 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus
aryabhattai . 88
ix



Bảng 4.19 Mã di truyền chuỗi nucleotide 90
Bảng 4.20 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào vi
khuẩn và chỉ số OD 660 92
Bảng 4.21 Ảnh hưởng của thời gian, độ pH và nhiệt độ đến tỷ lệ kết tụ
của 2 chủng vi khuẩn 98
Bảng 4.22 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của
yếu tố nhiệt độ, thời gian và pH đến chủng vi khuẩn
Bacillus aryhadtai KG12S 100
Bảng 4.23 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ
đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi khuẩn 102
Bảng 4.24 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ tinh bột, glutamate và
CaCl 2 đến tỷ lệ kết tụ sinh học . 103
Bảng 4.25 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ glucose, glutamate và
K 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 đến tỷ lệ kết tụ sinh học 103
Bảng 4.26 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3
nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium LA51P 105
Bảng 4.27 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3
nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus aryhadtai
KG12S 106
Bảng 4.28 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào của
hai chủng vi khuẩn sau khi tối ưu 110
Bảng 4.29 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất
protein ở điều kiện tối ưu . 111
Bảng 4.30 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất
polysaccharide ở điều kiện tối ưu . 112
Bảng 4.31 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn cho tỷ lệ kết tụ sin học
cao ở 2 môi trường phân lập . 113
Bảng 4.32 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ các mẫu chất thải
sau biogas của các trại chăn nuôi heo 116
Bảng 4.33 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các
chủng vi khuẩn ở thể tích 10 lít 120
Bảng 4.34 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau
hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 100 lít . 121
Bảng 4.35 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau
hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 1 m 3
. 122
Bảng 4.36 Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong nước thải sau hệ thống
biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 40 m 3
sau xử lý . 123

x



DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Mô hình quản lý chất thải rắn chăn nuôi trên thế giới 6
Hình 2.2 Xử lý nguồn chất thải chăn nuôi ở Việt Nam . 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo kaolin 10
Hình 2.4 Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500 . 12
Hình 2.5 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S
rDNA của vi khuẩn 8-37-0-1 17
Hình 2.6 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S
rDNA của vi khuẩn Klebsiella sp. 17
Hình 2.7 Quy trình phân lập, nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học . 18
Hình 2.8 Đa hình đơn nucleotide (SNPs) và haplotype . 21
Hình 2.9 Quy trình ứng dụng chỉ số SNP trong công nghệ sinh học 22
Hình 2.10 Quy trình phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học vào xử lý nước thải . 32
Hình 3.1 Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ
giọt 37
Hình 3.2 Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học . 39
Hình 3.3 Pha loãng mẫu phân lập (A), tách ròng khuẩn lạc (B) các
dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 40
Hình 3.4 Tóm tắt các bước nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học bằng kỹ thuật sinh học phân tử 41
Hình 3.5 Chu kỳ gia nhiệt (thực hiện phản ứng PCR) . 43
Hình 3.6 Phương pháp xác định tỷ lệ kết tụ sinh học bằng dung dịch
kaolin 48
Hình 4.1 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học 57
Hình 4.2 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
protein . 61
Hình 4.3 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học protein . 65
Hình 4.4 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
polysaccharide 68
Hình 4.5 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide . 72
Hình 4.6 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học 78
xi



Hình 4.7 Giá trị đa dạng nuleotide (Pi) biến đổi theo trình tự chuỗi
nucleotide . 79
Hình 4.8 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học protein . 81
Hình 4.9 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide . 82
Hình 4.10 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 18 chủng vi khuẩn tổng hợp Protein . 84
Hình 4.11 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 16 chủng vi khuẩn tổng hợp polysaccharide 84
Hình 4.12 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus megaterium
strain . 87
Hình 4.13 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus aryabhattai
strain . 87
Hình 4.14 Ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh khối đến hiệu quả kết tụ
sinh học của 2 chủng vi khuẩn . 91
Hình 4.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hiệu quả kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn 94
Hình 4.16 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi sinh khối đến hiệu quả
kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn 95
Hình 4.17 Ảnh hưởng của pH môi trường kaolin đến hiệu quả kết tụ
sinh học của hai chủng vi khuẩn 96
Hình 4.18 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết
tụ theo thời gian = 120 giờ, pH = X (5 - 7) và nhiệt độ = Y
(30 - 34) 99
Hình 4.19 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết
tụ ở nhiệt độ = 33 o C, Thời gian = X (96 - 144) và pH = Y
(5 - 7) 99
Hình 4.20 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn 107
Hình 4.21 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung đến khả
năng kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn . 108
Hình 4.22 Khối lượng chất kết tụ ly trích từ 100 ml dịch nuôi sinh
khối của hai chủng vi khuẩn 114
Hình 4.23 Tỷ lệ kết tụ của dịch sinh khối vi khuẩn và chất kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn 115
xii



Hình 4.24 Mối quan hệ thuận giữa pH chất thải và số dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học 117
Hình 4.25 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh
học của các chủng vi khuẩn 118
Hình 4.26 Nghiệm thức phối hợp chất trợ lắng với dịch vi khuẩn 118
Hình 4.27 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể
tích 8 lít . 119
Hình 4.28 Thử nghiệm xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại
chăn nuôi heo 119
Hình 4.29 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo biogas ở thể tích 1
m
3
122
Hình 4.30 Mô hình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
xử lý nước thải sau biogas trại chăn nuôi heo 124
Hình 4.31 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể
tích 40 m
3
124
Hình 4.32 Sơ đồ quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas 126






xiii



DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ANOVA Analysis Of Variance
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BOD Biochemical Oxygen Demand
Bp Base pair
BTNMT Bộ Tài Nguyên Môi Trường
BVMT Bảo Vệ Môi Trường
C Carbon
CBI Codon Bias Index
CFU Colony-Forming Unit
COD Chemical Oxygen Demand
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
C/N Carbon/Nitrogen
CV Coefficient of Variation
dATP Deoxyadenosine Triphosphate
dCTP Deoxycytidine Triphosphate
ddNTPs Dideoxynucleotide Triphosphates
dGTP Deoxyguanosine triphosphate
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates
dTTP Deoxythymidine Triphosphate
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EPS Exopolysaccharides
FTIR Fourier Transform Infrared
GDP Gross Domestic Product
HPAM Anionic Polyacrylamide
ITS Internal Transcribed Spacer
LSD Least Significant Difference
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
MPN Most probable number
NCBI National Center for Biotechnology Information
NC & PT Nghiên Cứu và Phát Triển
NCS Nghiên Cứu Sinh
Ngđ Ngày đêm
OD Optical Density
PAC Poly Aluminum Chloride
PAM Nonionic Polyacrylamide
xiv



PCR Polymerase Chain Reaction
PGA Poly-glutamic Acid
Pi Polymorphism in information
QCVN Quy Chuẩn Việt Nam
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
SBR Sequencing Batch Reactor
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SEM Scanning Electron Microscope
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SS Suspended Solid
TAE Tris-acetate-EDTA
TBE Tris-borate-EDTA
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
TE Tris-EDTA
TN Total Nitrogen
TP Total Phosphorus
TSS Total Suspended Solids
UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket
UV Ultraviolet
VSV Vi Sinh Vật
VK Vi Khuẩn
WHO World Health Organization
XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy
xv



TÓM TẮT
Đề tài “Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng
dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu
Long” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường thuộc Viện
nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và các
phòng thí nghiệm có liên quan từ tháng 10/2010 đến tháng 08/2014.
Mục tiêu luận án là (i) phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có tỷ lệ kết tụ cao từ nước thải sau biogas
của trại chăn nuôi heo ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long; (ii) đánh giá đa
dạng di truyền các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn; (iii) tiến hành tối ưu hóa điều
kiện tổng hợp chất kết tụ sinh học của 2 dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học
cao nhất, đặc trưng cho từng môi trường phân lập và ứng dụng xử lý nước thải
chăn nuôi heo sau biogas.
Kết quả phân lập được 221 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
trên 2 môi trường chọn lọc có tỷ lệ kết tụ từ 1,21 - 80,28%. Khảo sát 34 dòng
vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được tuyển chọn, có tỷ lệ kết tụ từ
21,34 - 80,28% cho thấy đa số khuẩn lạc hình tròn, có bề mặt ướt và nhày
nhớt, tế bào vi khuẩn chủ yếu có dạng hình que, chuyển động và thuộc nhóm
Gram dương. Xây dựng cây phả hệ di truyền dựa vào trình tự gen 16S rRNA
bằng phương pháp Maximum-Likelihood, đánh giá đa dạng nucleotide thông
qua chỉ số đa hình trình tự nucleotide (Pi), đa hình chiều dài nucleotide (Theta)
và số Haplotype. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền 18 dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học protein, có 14/18 dòng vi khuẩn tương đồng 97-
99% với các chủng thuộc loài Bacillus megaterium; có 3/18 dòng vi khuẩn
tương đồng 98-99% với các chủng thuộc loài Bacillus aryabhattai; dòng vi
khuẩn còn lại tương đồng 100% với chủng thuộc chi Bacillus sp Qua khảo
sát 16 dòng vi khuẩn tổng hợp hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide có
11/16 dòng vi khuẩn tương đồng với chi Bacillus; 3/16 dòng vi khuẩn tương
đồng với chi Klebsiella; 2/16 dòng vi khuẩn thuộc chi Sphingobacterium. Xác
định mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn, có 24/34 chủng vi khuẩn
tương đồng 99-100% thuộc loài Bacillus megaterium và loài Bacillus
aryabhattai; 10/34 chủng tương đồng 98-100% thuộc loài Klebsiella
pneumoniae, Bacillus amyloliquefaciens và Sphingobacterium sp. và các chỉ
số đa dạng nucleotide giữa các chủng vi khuẩn này lần lượt là Pi = 0,090,
Theta = 0,156 và Haplotypes = 16. Từ các kết quả trên cho thấy sự đa dạng di
truyền của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cũng như sự đa
dạng sinh học của vi khuẩn trong tự nhiên. Kết quả tối ưu điều kiện tổng hợp
xvi



chất kết tụ sinh học của 2 chủng vi khuẩn đặc trưng cho 2 môi trường phân
lập: (1) Điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus megaterium strain
LA51P: pH môi trường nuôi cấy 5,7, nhiệt độ 29 o C và thời gian 124 giờ với
thành phần môi trường tối ưu gồm tinh bột (0,85%), glutamate (6,6%) và
CaCl 2 (0,9%) cho tỷ lệ kết tụ 95,78% với dung dịch kaolin ở pH 7, sau 5 phút
để lắng, bổ sung dung dịch MgSO 4 (0,1%) và 0,2% dịch nuôi sinh khối vi
khuẩn. Khối lượng chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu là
4,9g/l cho tỷ lệ kết tụ tương đương với dịch vi khuẩn. (2) Điều kiện tối ưu cho
chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai strain KG12S: pH môi trường nuôi cấy
5,9, nhiệt độ 29 o C và thời gian 122 giờ với thành phần môi trường tối ưu cho
khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học gồm glucose (1,12%), glutamate
(5,7%), K 2 HPO 4 (0,4%) và KH 2 PO 4 (0,8%) cho tỷ lệ kết tụ 96,87% với dung
dịch kaolin sau 5 phút để lắng, bổ sung dung dịch CaCl 2 (0,1%) và 0,2% dịch
nuôi sinh khối vi khuẩn. Chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu
là 4,8g/l và tỷ lệ kết tụ với dung dịch kaolin tương đương với dịch vi khuẩn.
Ứng dụng 2 chủng vi khuẩn trong thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải
sau hệ thống biogas của trại chăn nuôi heo đều cho hiệu quả tốt, ở thể tích 40
m
3
các chỉ tiêu phân tích COD (< 75 mg/l), TSS (< 50 mg/l) và BOD (< 30
mg/l) đạt tiêu chuẩn A theo quy chuẩn QCVN_40/2011/BTNMT.
Từ khóa: Bacillus sp, đa dạng di truyền của vi khuẩn, kết tụ sinh học,
nước thải sau biogas, tỷ lệ kết tụ, vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học