Thạc Sĩ Chuyển gen Retrotransposon Tnt1 vào cây đậu nành (Glycine max) bằng phương pháp Agrobacterium tumefa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2011

MỤC LỤC

MỤC LỤC . i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BẢNG . viii
MỞ ĐẦU 1
1 TỒNG QUAN . 3
1.1 Cây đậu nành . 3
1.1.1 Vị trí phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm sinh học 3
1.1.3 Điều kiện nuôi trồng . 4
1.1.4 Nguồn gốc, phân bố và sản lượng đậu nành trên thế giới 4
1.1.5 Thành phần dinh dưỡng của hạt đậu nành . 5
1.1.6 Nuôi cấy mô, tạo vật liệu cho quá trình chuyển gen ở cây đậu
nành 5
1.1.7 Giá trị thương mại của cây đậu nành . 7
1.2 Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens . 8
1.2.1 Phân loại vi khuẩn A. tumefaciens . 8
1.2.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh của A. tumefaciens . 8
1.2.3 Ti plasmid . 8
1.2.4 Quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens . 10
1.2.5 Ứng dụng Ti plasmid trong công nghệ gen thực vật 11
1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen bằng A. tumefaciens 12
1.3 Một số phương pháp chuyển gen khác 17
1.3.1 Phương pháp bắn gen . 18

1.3.2 Phương pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium- mediated transformation) . 18
1.3.3 Phương pháp lọc chân không . 19
1.3.4 Phương pháp Floral-dip 19
1.3.5 Phương pháp Agrolistic 19
1.3.6 Vi tiêm DNA 19
1.3.7 Vi sợi "whiskers" 20
1.3.8 Phương pháp PEG (Polyethylene glycol) 20
1.3.9 Phương pháp xung điện 20
1.4 Retrotransposon . 20
1.4.1 Giới thiệu 21
1.4.2 Cơ chế chuyển vị của retrotransposon . 21
1.4.3 Phân loại retrotransposon thực vật . 22
1.4.4 Phân lập và ứng dụng LTR retrotransposon thực vật . 23
1.4.5 Retrotransposon Tnt1 . 24
1.5 Nghiên cứu chọn tạo giống đậu nành trên thế giới . 25
1.5.1 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp truyền thống . 25
1.5.2 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp chuyển gen . 26
1.6 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong phân tích cây chuyển gen . 32
1.6.1 Phương pháp thử in vitro và ex vitro khả năng biểu hiện gen chọn
lọc bar của cây chuyển gen 32
1.6.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng
hợp dây chuyền dùng polymerase) . 32
1.6.3 Điện di trên gel agarose 34

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35
2.1 Vật liệu 35
2.1.1 Đậu nành . 35
2.1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và plasmid . 36
2.1.3 Vật liệu cho các thí nghiệm sinh học phân tử 36
2.2 Phương pháp 38
2.2.1 Tách chiết plasmid pZY 101 – Tnt1 và kiểm tra sự hiện diện của
Tnt1 bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn . 38
2.2.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành . 39
2.2.3 Các bước thực hiện quy trình chuyển gen bằng A. tumefaciens
trên mẫu lá mầm cây đậu nành . 40
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi
chưa chuyển gen . 43
2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả
chuyển gen 44
2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen 44
2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả
chuyển gen 45
2.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 sau khi đồng nuôi cấy 45
2.2.9 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm . 47
2.2.10 Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngoài vườn
ươm bằng phương pháp leaf – painting 48
2.2.11 Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện
diện của gen bar trong genome bằng phương pháp PCR 49
2.3 Phương pháp xử lí số liệu 50
2.4 Điều kiện thí nghiệm . 50

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN . 52

3.1 Tách chiết plasmid pZY 101 – Tnt1 và kiểm tra sự hiện diện của Tnt1
bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn 52
3.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành 53
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen . . 54
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả chuyển gen . 56

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen . 60
3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 62
3.7 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 sau khi đồng nuôi cấy . 64
3.7.1 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp
với timentin lên sự phát triển của vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 64
3.7.2 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy . 66
3.8 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm 69
3.9 Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngoài vườn ươm
bằng phương pháp leaf – painting . 71
3.10 Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện diện của
gen bar trong genome bằng phương pháp PCR 73

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 76

4.1 Kết luận 76
4.2 Đề nghị 77
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79
PHỤ LỤC




DANH MỤC HÌNH


Hình 1. 1: Cây đậu nành . 3
Hình 1. 2: Các quốc gia chính sản xuất đậu nành trên thế giới, thống kê năm
2009 4
Hình 1. 3: Tái sinh in vitro cây đậu nành thông qua việc tạo phôi soma . 6
Hình 1. 4: Một số sản phẩm từ đậu nành 7
Hình 1. 5: Trồng và thu hoạch đậu nành tại Mỹ . 7
Hình 1. 6: Agrobacterium tumefaciens . 8
Hình 1. 7: Cấu tạo của Ti plasmid 9
Hình 1. 8: Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens . 10
Hình 1. 9: Sơ đồ cấu trúc các loại retrotransposon . 22
Hình 1. 10: Cơ chế chuyển vị của DNA transposon và retrotransposon 22
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Hình 2. 1: Cấu trúc plasmid pZY 101 và pSH – Tnt1. . 36
Hình 2. 2: Bình hút ẩm dùng để khử trùng (A) và hạt đã khử trùng trên môi trường GM (B) 40
Hình 2. 3: Quy trình tạo vết thương trên vùng nốt lá mầm. . 41
Hình 2. 4: Mẫu lá mầm đậu nành sau khi ủ chung với vi khuẩn trên môi trường
đồng nuôi cấy. 42
Hình 2. 5: Khuẩn lạc A. tumefaciens AGL1 mang plasmid pZY 101 – Tnt1 trên
môi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin. . 42

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Hình 3. 1: Kết quả điện di plasmid pZY 101 – Tnt1 và plasmid pZY 101 – Tnt1
cắt với enzyme EcoRI . 52
Hình 3. 2: Hạt đậu nành giống Maverick đã khử trùng (A) và nảy mầm 5 ngày
trên môi trường GM (B) . 53
Hình 3. 3: Biểu đồ ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen. . 55
Hình 3. 4: Ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển
gen sau 2 tuần nuôi cấy 55
Hình 3. 5: Biểu đồ ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu nành. . 57
Hình 3. 6: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy: A – giai đoạn tái sinh, B – giai đoạn chọn lọc, C – giai đoạn kéo dài lần cấy chuyền thứ 1, D – giai đoạn kéo dài lần cấy chuyền
thứ 2. . 58
Hình 3. 7: Chồi trên môi trường SI không glufosinate (A) và có 10 mg/l glufosinate (B) quan sát dưới kính lúp . 59
Hình 3. 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả biến nạp gen . 61
Hình 3. 9: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen.
Hình 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen
qua các giai đoạn nuôi cấy 63
Hình 3. 11: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự
phát triển của A. tumefaciens AGL1. . 65
Hình 3. 12: Biểu đồ ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy. 67
Hình 3. 13: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên
sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu qua các giai đoạn nuôi cấy 68
Hình 3. 14: Chọn lọc chồi và ra rễ in vitro . 70
Hình 3. 15: Cây đậu nành chuyển gen trong phòng tăng trưởng . 71
Hình 3. 16: Cây đậu nành chuyển gen sau 15 ngày chuyển ra nhà kính. . 72
Hình 3. 17: Thử nghiệm leaf – painting ngoài vườm ươm 73
Hình 3. 18: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen bar 74

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Hình 4. 1: Quy trình chuyển gen trên đậu nành bằng phương pháp
Agrobacterium tumefaciens. . 77



TỔNG QUAN
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1: Một số công trình nghiên cứu về chuyển gen đậu nành công bố trong
và ngoài nước. 29

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Bảng 2. 1: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy in vitro cây đậu nành 35
Bảng 2. 2: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen bar . 50
Bảng 2. 3: Chương trình PCR khuếch đại gen bar . 50

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Bảng 3. 1: Kết quả đo NanoDrop plasmid pZY 101 – Tnt1 . 52
Bảng 3. 2: Ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen 54
Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu nành. 57
Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen . 60
Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen . 62
Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên
sự phát triển của A. tumefaciens AGL1. . 65
Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự
loại bỏ vi khuẩn qua các giai đoạn nuôi cấy của quá trình chuyển gen . 66

MỞ ĐẦU

Thuốc lá chuyển gen ra đời đầu tiên năm 1983 đã mở đầu cho sự phát triển và tiến bộ của cây chuyển gen. Các loại cây trồng chuyển gen như đậu nành, bông vải, bắp, lúa và các loại cây cảnh đã được nghiên cứu rộng rãi và thương mại hóa trên thế giới. Theo thống kê của ISAAA (2010), có 14 triệu nông dân, ở 25 quốc gia, trồng 134 triệu hecta cây biến đổi gen vào năm 2009, tăng 7% so với năm 2008.
Đậu nành là một trong những cây thực phẩm có hàm lượng dầu thực vật và dinh dưỡng cao, dễ trồng và có hiệu quả kinh tế. Sản phẩm từ cây đậu nành được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc. Ngoài ra, dầu và protein của đậu nành còn được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực công nghiệp và dầu sinh học (biodiesel). Năm 2009, sản lượng đậu nành chiếm 53% hạt có dầu trên toàn thế giới. Mỹ là nước sản xuất đậu nành lớn nhất thế giới với 31,4 triệu hecta đạt doanh thu 31,9 tỉ đô la, trong đó 34,9 triệu tấn đậu nành đã được xuất khẩu thu về 21 tỉ đô la. Trung Quốc là khách hàng tiêu thụ đậu nành lớn nhất của Mỹ với 9,2 tỉ đô la, Mexico xếp thứ 2 với 1,3 tỉ đô la [63].
Tại Việt Nam, đậu nành là cây thực phẩm quan trọng với nhu cầu tiêu thụ ngày càng tăng cao, tuy nhiên năng suất cây trồng này còn thấp, bình quân chỉ khoảng 1,9 tấn/ha. Vì vậy việc áp dụng các phương pháp biến đổi, tạo giống mới, tạo nhiều biến dị tốt là cần thiết để giúp nâng cao năng suất đậu nành. Kỹ thuật chuyển gen có thể đưa ra một con đường hiệu quả hơn các phương pháp truyền thống cho phép đưa các tính trạng đặc biệt vào cây đậu nành như khả năng kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tổng hợp acid amin, tăng hàm lượng acid béo, sản xuất dầu sinh học
Kể từ khi nghiên cứu chuyển gen trên cây đậu nành đầu tiên được công bố vào năm 1988 (Hinchee và cộng sự, 1988; McCabe và cộng sự, 1988), đậu nành biến đổi gen đã được nghiên cứu phát triển và nhân giống rộng rãi bởi các nhà sản xuất của Mỹ, Argentina, Canada, Brazil 77% đậu nành thương mại hóa trên thị trường là đậu nành đã biến đổi gen. Genome của đậu nành cũng đã được giải trình tự trong thời gian gần đây bởi các nhà nghiên cứu của viện Energy – Joint Genome (DOE - JGI) mở ra nhiều cơ hội mới cho công tác nhân giống và chuyển gen đậu nành. Có khoảng 60.000 gen được phân tích trong đó 5.671 là các nhân tố phiên mã sẽ quyết định kiểu hình bao gồm kháng hạn, kháng ngập úng, nồng độ protein và dầu cao [55] Tuy nhiên, khoảng 45 – 50.000 gen của đậu nành đến nay vẫn còn chưa rõ chức năng. Do đó, nhiệm vụ các nhà nghiên cứu di truyền cây đậu nành là tập trung vào việc tìm hiểu các gen quy định các tính trạng có lợi cho con người. Việc ứng dụng các nhân tố chuyển vị trong chuyển gen trên thực vật nhằm tạo ra các quần thể đột biến không chỉ với mục tiêu làm đa dạng giống loài mà còn là một trong những công cụ đắc lực cho việc tìm hiểu chức năng của gen thông qua di truyền ngược. Các nhân tố chuyển vị được ứng dụng cho thực vật bao gồm: retrotransposon Tnt1 (phân lập từ cây thuốc lá), Ac/Ds (phân lập từ cây bắp) và mPing (phân lập trên lúa)

Trong thời gian gần đây ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về chuyển gen vào thực vật gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu được thực hiện trên cây đậu nành. Do đó, mục đích nghiên cứu của luận văn “Chuyển gen Retrotransposon Tnt1 vào cây đậu nành (Glycine max) bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens” là tối ưu hóa một số thông số của qui trình chuyển gen dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên cây đậu nành, đồng thời thử nghiệm biến nạp gen mã hóa retrotransposon Tnt1 nhằm tạo ra các quần thể mang đột biến chèn cho nghiên cứu kiểu hình và làm vật liệu cho các nghiên cứu di truyền ngược tìm hiểu chức năng của gen.