Luận Văn Chức năng các gene ứng viên liên quan đến tính kháng bệnh ghẻ củ do vi khuẩn streptomyces scabies ở

TÊN ĐỀ TÀI: Chức năng các gene ứng viên liên quan đến tính kháng bệnh ghẻ củ do vi khuẩn streptomyces scabies ở khoai tây bằng tin sinh học và công nghệ mirna​

Information


TÓM TẮT

Gene TXR1 ở Arabidopsis thaliana mã hóa cho một protein có vai trò trong sự điều hòa vận chuyển thaxtomin A - tác nhân chính gây ra bệnh ghẻ củ khoai tây vào trong tế bào. Protein TXR1 có các trình tự tương đồng cao trên các loài thực vật khác nhau, thậm chí trên cả động vật và người. Trình tự bảo tồn của TXR1 (từ vị trí 204 đến vị trí 554 trên mRNA TXR1) đã được nhân dòng và xác định trình tự trên giống khoai tây Atlantic, đồng thời xác định trình tự này cũng có 3 intron và 4 exon. Bên cạnh đó, một trình tự khác cũng có khả năng liên quan đến cơ chế kháng/nhiễm bệnh ghẻ củ khoai tây là CV470003.1 cũng đã được nhân dòng. AmiRNA là công cụ hiệu quả cho việc làm câm gene, ứng dụng trong nghiên cứu chức năng ở thực vật. Dựa vào khung ath-miR319a precursor, cấu trúc vector mang trình tự amiRNA-1 đặc hiệu cho gene mục tiêu là CV470003.1 đã thiết kế. Cấu trúc này sau đó được chuyển vào khoai tây để đánh giá tác động của amiRNA-1 đến sự biểu hiện của gen mục tiêu.

Từ khóa: amiRNA, common scab, miRNA, thaxtomin A, TXR1 gene.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong số nhiều bệnh gây hại trên khoai tây, bệnh ghẻ gây hại bởi vi khuẩn Streptomyces scabies là một trong những bệnh nghiêm trọng, phân bố rộng và xảy ra ở hầu hết các vùng trồng khoai tây trên thế giới (Lambert và Loria, 1989). Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất củ. Theo điều tra của Đặng Thị Dung và cộng sự (2003), hầu hết các vùng trồng khoai tây ở Việt Nam đều bị ảnh hưởng bởi bệnh này. Thaxtomin A được cho là nguyên nhân gây bệnh ghẻ củ ở khoai tây (Delserone và cộng sự, 1991; Acuna và cộng sự, 2001). Năm 2003, Scheible và cộng sự công bố phát hiện của họ về đột biến kháng với thaxtomin A ở Arabidopsis, gọi là txr1. Ông cũng tìm được gen tương ứng với đột biến này là TXR1, gen này mã hoá cho một protein mới có trình tự bảo thủ tương đồng với tất các các sinh vật nhân thật. Protein được mã hóa bởi gene TXR1 được giả thuyết là có vai trò điều hòa hoặc tham gia vào quá trình vận chuyển thaxtomins vào trong tế bào. Dựa vào các thông tin đã công bố, nghiên cứu này được tiến hành nhằm xác định ở khoai tây có gene TXR1 hay không và gene này có vai trò như thế nào trong cơ chế kháng hay nhiễm bệnh ghẻ củ ở khoai tây?

Công nghệ miRNA được phát triển gần đây đã và đang tỏ ra là công cụ hiệu quả để điều hoà ức chế các gen đơn hoặc các nhóm gen khác nhau trên cơ sở các trình tự đặc hiệu. Việc sử dụng thành công các miRNA nhân tạo để điều hoà ức chế các gen cũng đã được công bố trên các cây hai lá mầm như Arabidopsis, cà chua và thuốc lá và cây một lá mầm như lúa (Parizotto và cộng sự, 2004; Alvarez và cộng sự, 2006; Schwab và cộng sự, 2006; Warthmann và cộng sự, 2008). Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các công cụ tin sinh học, nhân dòng và miRNA nhằm bước đầu tìm hiểu về trình tự và chức năng của các gen ứng viên cho TXR1. Các phát hiện về gene TXR1 ở khoai tây sẽ góp phần cung cấp thông tin về cơ sở di truyền của tính kháng, làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của thaxtomins ở khoai tây ở mức phân tử và từ đó sẽ góp phần phát triển các chiến lược phòng chống bệnh mới trên khoai tây và các cây trồng khác.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


Vật liệu:

DNA chiết tách từ mô lá giống atlantic


Các vector

Vector khung- pRS300 chứa ath-miR319a precursor (cung cấp bởi Detlef Weigel, Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Developmental Biology, Germany). Vector nhân dòng pZET1.2/blunt (Fermentas). Vector biểu hiện pPS1 (cung cấp bởi Walter de Jong, Cornell University, USA).

Tìm kiếm, phân tích các trình tự tương đồng

Sử dụng công cụ BLAST trên NCBI với các cơ sở dữ liệu khác nhau (EST, HTGS) và công cụ ORF Finder để phân tích các đặc trưng của trình tự.

Nhân dòng gene và đọc trình tự

Sử dụng vector pZET1.2/blunt (Fermentas). Xác định trình tự nhân dòng theo bộ kit Bigdye terminator v3.1 và kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm DNAstar (Lasergene v7.1).

Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật mang amiRNA (miRNA nhân tạo)

Sử dụng WMD3 để thiết kế amiRNA đặc thù cho trình tự mRNA mục tiêu. Nhân dòng các amiRNA sử dụng vector RS300 theo quy trình của Rebecca Schwab và cộng sự (2006). Sản phẩm nhân dòng được tái tổ hợp vào vector pPSI để tạo nên vector biểu hiện ở thực vật

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tìm kiếm, phân tích các trình tự tương đồng

Kết quả tìm kiếm trình tự các gene ứng viên TXR1 ở khoai tây cho thấy có tính đồng nhất cao giữa CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1 với trình tự gene TXR1 (NM_115790) ở Arabidopsis (lần lượt là 72%, 72%, 71%) và với trình tự gene ứng viên TXR1 ở cà chua (AI781901.1) (lần lượt là 96%, 96%, 95%). Kết quả căn trình tự ở mức độ nucleotide và amino acid cho thấy: vùng bảo thủ nằm ở vị trí 138-482 trên CX161514.1, vị trí 114-458 trên DN849236.1 và 112-156 trên CK852098; tương ứng với vị trí 204-554 trên trình tự mRNA của gene TXR1 (NM_115790.2) ở Arabidopsis và vị trí 158-502 trên trình tự gene ứng viên TXR1 ở cà chua (AI781901.1).

Kết quả tìm kiếm trình tự gene ứng viên TXR1 ở khoai tây cũng cho thấy, trình tự CV470003.1 cũng có tính đồng nhất cao với trình tự TXR1 (NM_115790.2) ở Arabidopsis (71%) và với trình tự gene ứng viên TXR1 ở cà chua (95%). Đây là trình tự cDNA thu được khi củ khoai tây bị nhiễm bệnh ghẻ. Bởi vậy rất có thể trình tự này cũng có liên quan đến sự cảm ứng kháng/nhiễm bệnh ghẻ trên khoai tây.Từ các trình tự tương đồng trên, 2 nhóm trình tự được lựa chọn như sau:

- Nhóm 1: gồm các trình tự CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1.

- Nhóm 2: gồm trình tự CV470003.1

Trên Arabidopsis thaliana, dựa vào sự so sánh trình tự cDNA (NM_115790.2) với trình tự genome (At3g59280, mã số genbank: AI112727.1) đã chứng tỏ rằng gene TXR1 bao gồm 3 và 4 exon (Scheible và cộng sự, 2003). Kết quả phân tích các trình tự gene ứng viên TXR1 ở khoai tây cho thấy các trình tự này cũng mang 3 intron và 4 exon.



Hình 1 : Sản phẩm PCR với cặp mồi F7-R7 trên giống Atlantic

Nhân dòng các gene ứng viên

11 cặp mồi khác nhau được thiết kế cho nhóm trình tự thứ nhất để thực hiện nhân dòng bằng PCR, trong đó cặp mồi F7-R7 thiết kế cho vị trí vùng bảo thủ, các cặp mồi còn lại được thiết kế nhằm nhân toàn bộ chiều dài của gene.

Kết quả PCR cho thấy, chỉ có cặp mồi F1-R5, F1-R6 và F7-R7 cho sản phẩm, trong đó chỉ có sản phẩm nhân bằng cặp mồi F7-R7 cho sản phẩm có kích thước như dự đoán (900-950 bp) (Hình 1). Với kích thước này có thể trình tự nhân được có chứa 2 intron (intron số 2, 3) và 3 exon (số 2, 3, 4).

Để kiểm chứng dự đoán về cấu trúc của trình tự vừa nêu, các sản phẩm này được xác định trình tự. Kết quả cho thấy, chỉ có sản phẩm được nhân lên bằng cặp mồi F7-R7 (gọi là At-F7R7) liên quan đến trình tự mục tiêu. Sản phẩm này có kích thước 917 nts, đúng như dự