Luận Văn Bước đầu xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp real-time pcr

TÓM TẮT


Nguyễn Hữu Trưởng, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. BưỚC


ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LưỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI


GEN BẰNG PHưƠNG PHÁP REAL-TIME PCR.


Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn và Th.S Nguyễn Thái Thủy.


Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại Phòng thí nghiệm Công


nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành


phố Hồ Chí Minh.


Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S


bằng phương pháp Real-Time PCR. Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của


phương pháp. Định lượng một số mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp trên thị trường Tp


Hồ Chí Minh và phụ cận.


Đề tài đã có những kết quả sau:


Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen:


- Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. Quy trình đề nghị:


dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein:


phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol.


- Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị:


Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I.


Kết quả thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm có promoter 35S cho vạch khuếch


đại có kích thước 123 bp với nhiệt độ nóng chảy 86-86,5oC.


- Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa


trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman.


Kết quả đánh giá: phương pháp Real-Time PCR có khả năng phát hiện và


định lượng 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm, định lượng chính xác


một mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước.


- Khảo sát một số mẫu sản phẩm cho thấy, trên thị trường Việt Nam có sản phẩm


chuyển gen ở các dạng thực phẩm và thức ăn khác nhau.


MỤC LỤC


LỜI CẢM TẠ iii


TÓM TẮT iv


MỤC LỤC .vi


CHỮ VIẾT TẮT .xi


DANH MỤC HÌNH xii


DANH MỤC BẢNG xiv


PHẦN I: MỞ ĐẦU 1


1.Đặt vấn đề .1


2.Mục đích và yêu cầu 2


2.1.Mục đích .2


2.2.Yêu cầu .2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3


1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) . 3


2. Quá trình tạo sinh vật GMO 3


2.1.Quá trình cơ bản .3


2.2.Promoter CaMV 35S 4


3.Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen . 6


3.1.Ứng dụng 6


3.1.1. Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] 6


3.1.2. Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17] . 7


3.2.Tác động có lợi của thực vật chuyển gen .8


4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới . 9


4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới 11


5.Ảnh hưởng bất lợi và dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 12


5.1.Các rủi ro có thể gặp [34] .12


5.2.Tác động có hại 12


5.2.1. Môi trường 13


5.2.2. Sức khoẻ người tiêu dùng . 13


5.2.3. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể 14


5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .14


6. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới 16


6.1.Quy định tại châu Âu [33]: .17


6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA . 18


6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu . 19


6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 19


6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen . 19


7. Tình hình Việt Nam . 21


7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen 21


7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen .21


8. Các phương pháp định lượng sản phẩm chuyển gen . 22


8.1.Phương pháp ELISA 23


8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] 23


8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR .24


8.3.1. Hóa chất định lượng . 24


8.3.1.1. SYBR Green I 25


8.3.1.2. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) . 25


8.3.2. Công cụ phát hiện . 27


8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR 28


8.4.1. Quan hệ định lượng 28


8.4.2. Thiết kế thí nghiệm . 29


8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR 30


8.4.4. Tính toán hàm lượng GMO 31


8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen


[9][44]32


8.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên


promoter 35S. .34


8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S . 34


8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S 35


PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 36


1.Nội dung nghiên cứu 36


2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm . 36

2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm .36


2.2.Thời gian thực hiện .36


3.Tiến trình thí nghiệm: . 36


4.Vật liệu thí nghiệm . 37


5.Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA 38


5.1.Mục tiêu 38


5.2.Vật liệu .38


5.3.Phương pháp thực hiện .38


5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích .41


6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 41


6.1.Mục tiêu 41


6.2.Nguyên tắc 41


6.3.Vật liệu thí nghiệm .42


6.4.Trang thiết bị 42


6.5.Phương pháp thực hiện .43


6.5.1. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR . 43


6.5.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại 43


6.5.3. Phát hiện sản phẩm khuếch đại . 44


6.5.4. Phân tích kết quả . 45


7.Thí nghiệm 3: Xác định phương pháp định lượng sản phẩm biến đổi gen 46


7.1.Mục tiêu 46


7.2.Nguyên tắc 46


7.3.Vật liệu thí nghiệm .46


7.4.Trang thiết bị 46


7.5.Phương pháp thực hiện .46


7.5.1. Bố trí thí nghiệm . 46


7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S 47


7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng 48


7.5.2. Thành phần phản ứng PCR . 48


7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix 49


7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix . 49


7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 49


7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển . 50


7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm 51


8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR.


.54


8.1.Mục tiêu 54


8.2.Nguyên tắc 54


8.3.Vật liệu thí nghiệm .54


8.4.Trang thiết bị 54


8.5.Hóa chất 54


8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix . 55


8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference


calibration DNA standards) . 55


8.6.Phương pháp thực hiện .55


8.6.1. Bố trí thí nghiệm . 56


8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng 56


8.6.1.2. Độ chính xác: 56


8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng 56


8.6.3. Thành phần phản ứng Real-Time PCR . 57


8.6.4. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 57


8.6.5. Phân tích kết quả . 58


9.Ứng dụng phương pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trường58


9.1.Mục tiêu 58


9.2.Nguyên tắc 58


9.3.Vật liệu thí nghiệm .58


9.4.Trang thiết bị và hóa chất .58


9.5.Phương pháp thực hiện .59


9.5.1. Bố trí thí nghiệm . 59


9.5.2. Thiết kế phản ứng định lượng 59


9.5.3. Thành phần phản ứng và chương trình nhiệt thiết lập 59


9.5.4. Phân tích kết quả . 59


PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .60


1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA . 60


2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 63


2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống .63


2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green .65


3.Thí nghiệm 3: Xác định phương pháp định lượng GMO 71


3.1.Xây dựng đường chuẩn: .71


3.2.Đánh giá kết quả định lượng 74


4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR


.76


4.1.Độ nhạy của phương pháp: .76


4.2.Độ chính xác của phương pháp 78


5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phương pháp định lượng Real-Time PCR . 79


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .85


1.Kết luận . 85


2.Đề nghị 86


TÀI LIỆU THAM KHẢO 87


PHỤ LỤC .92