Luận Văn Bước đầu xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp real-time pcr

4


TÓM TẮT


Đề tài "Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh đỏđầu lá trên

chồi dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR" được thực hiện tại phòng thí nghiệm

CNSH – Trung tâm phân tích thí nghiệm – trường Đại học Nông Lâm TPHCM từ

ngày 15/3/2005 đến ngày 15/8/2005.

Đề tài được thực hiện bởi sinh viên Nguyễn Phú Dũng thuộc lớp CNSH khóa

27 dưới sự hướng dẫn của Ts. Trần Thị Dung - trưởng Bộ môn CNSH.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏđầu lá

trên cây dứa Cayenne. Bệnh đang hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới,

gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người trồng vì chưa có thuốc phòng trịđặc hiệu.

Mục đích của đề tài là xây dựng quy trình phát hiện PMWaV-1 trên chồi giống

dứa Cayenne bằng cách khuếch đại đoạn gen HSP 70 của virus với phương pháp

RT-PCR.


Nội dung nghiên cứu bao gồm:

Thu thập chồi giống dứa Cayenne.

Thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1.

Áp dụng quy trình vừa xây dựng, giám định PMWaV-1 trên 90 chồi dứa

Cayenne thuộc 3 giống: Thái Lan, Trung Quốc và Lâm Đồng.


Các kết quả thu được:

Ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa.

Xây dựng được quy trình RT-PCR phát hiện PMWaV-1 qua việc xác định

được các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer và số chu kỳ tối ưu cho

phản ứng.

Sản phẩm RT-PCR được giải trình tự cho thấy nằm đúng vùng gene

HSP 70 cần nhân bản và hoàn toàn đặc hiệu cho PMWaV-1. Như vậy, quy

trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy trong việc phát hiện

PMWaV-1

Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 trên cả 3 giống dứa Cayenne được giám định đều

rất cao, giống Thái Lan: 53,3%, giống Trung Quốc: 46,7% và giống Lâm

Đồng: 46,7%. Kết quả này cho thấy một nguy cơ lớn của bệnh héo đỏđầu

lá đang đe dọa người trồng dứa và đòi hỏi cấp thiết một phương pháp

phòng trừ bệnh hiệu quả.

5


MỤC LỤC


CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt .iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt .vii

Danh sách các bảng . viii

Danh sách các hình .ix


Phần 1: MỞĐẦU

1.1Đặt vấn đề 1

1.2Mục đích 2

1.3Yêu cầu 2


Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm chung của cây dứa. 3

2.2 Phân loại .4

2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa trên thế giới và ở Việt Nam 7

2.4 Bệnh héo đỏđầu lá trên cây dứa 9

2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏđầu lá trên thế giới và ở Việt Nam. .13

2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV .15

2.7 Gene HSP 70 của PMWaV-1 .16

2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 17

2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR .17

2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR .19

2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer) .19

2+ .

2.8.2.2 Mg 19

2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) .19

2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) 20

2.8.2.5 Taq – polymerase .20

2.8.2.6 Số chu kỳ của phản ứng PCR .21

2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR) .21

2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA. (Sequencing) .24

6


Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu. 25

3.1.1 Mẫu .25

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 25

3.1.3 Hóa chất 26

3.1.3.1 Hoá chất dùng cho tách chiết RNA .26

3.1.3.2 Hoá chất dùng cho phản ứng RT-PCR 26

3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA .27

3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA .28

3.2 Phương pháp nghiên cứu .28

3.2.1 Tách chiết RNA 28

3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA .29

3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR 30

3.2.3.1 Khảo sát độđặc hiệu của primer .30

3.2.3.2 Xác định chu kỳ nhiệt tối ưu .30

3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp .31

3.2.3.4 Xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR 31

3.2.4 Điện di sản phẩm RT-PCR .31

3.2.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR 32

3.2.6 Giám định chồi giống dứa .32


Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả ly trích RNA .33

4.2 Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR 34

4.2.1 Kết quả khảo sát độđặc hiệu của primer 34

4.2.2 Kết quả xác định chu kỳ nhiệt tối ưu 36

4.2.2 Kết quả xác định nồng độ primer thích hợp 38

4.2.3 Kết quả xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR. .39

4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự 42

4.4 Kết quả giám định chồi giống dứa 46


Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận. 49

5.2 Đề nghị 49


TÀI LIỆU THAM KHẢO .50


PHỤ LỤC 53