Luận Văn Bước đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng di truyền của nấm Magnaporthegrissea

TÓM TẮT KHÓA LUẬN


“Bước đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng


di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”.


Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN


Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp


Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến


phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea.


Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm


Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho


phù hợp.


Phương pháp nghiên cứu:


- Thực hiện ly trích và phân cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn


- Tiến hành phân tách các đoạn DNA cắt giới hạn trên gel agarose, chuyển


và cố định DNA lên màng


- Thực hiện phản ứng lai với phân tử probe là DNA plasmid được đánh dấu


và phát hiện bằng huỳnh quang


- Sử dụng phần mềm để phân tích tính đa dạng di truyền.


Kết quả:


- DNA ly trích tốt và thực hiện thành công phản ứng cắt giới hạn


- Biến nạp và ly trích thành công các loại plasmid được cung cấp để đánh


dấu sư dụng cho phản ứng lai phát hiện MAGGY trong genome của M. grisea


- Thực hiện phản ứng lai với probe pMGY-SB thành công đối mẫu đối


chứng là plasmid pMGY-SB.


Kết luận :


Do quy trình Southern blot chưa hoàn thiện trong điều kiện phòng thí nghiệm ở


TT PTTNHS của trường Đại học Nông Lâm và hạn chế về mặt thời gian nên


kết quả của phản ứng lai đã không đi đến thành công. Do đó, không có cơ sở để


phân tích sự đa dạng di truyền trên nấm M. grisea.


MỤC LỤC


PHẦN TRANG


Trang tựa


Lời cảm tạ i


Tóm tắt ii


Mục lục iii


Danh sách các chữ viết tắt .vi


Danh sách các hình .vii


Danh sách các bảng .viii


1. MỞ ĐẦU 1


1.1.Đặt vấn đề . 1


1.2.Mục đích – Yêu cầu 2


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3


2.1. Sơ lược về cây lúa . 3


2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) . 3


2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa . 3


2.2.2. Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa 4


2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh . 5


2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh 5


2.3. Phương pháp Southern blot 6


2.4. Enzyme cắt giới hạn . 7


2.5. Các phương pháp chuyển DNA lên màng 8


2.5.1. Phương pháp mao dẫn hướng lên 8


2.5.2. Phương pháp mao dẫn hướng xuống . 9


2.5.3. Phương pháp mao dẫn hai chiều . 9


2.5.4. Phương pháp chuyển bằng điện 9


2.5.5. Phương pháp chuyển bằng chân không . 9


2.6. Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot 10


2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea 10


2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích


đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea 12


3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14


3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành . 14


3.2. Đối Tượng khảo sát 15


3.3. Nội dung thực hiện . 15


3.4. Vật liệu và hóa chất 16


3.4.1. Dụng cụ và thiết bị 16


3.4.2. Hóa chất . 16


3.5. Phương pháp nghiên cứu 17


3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm M. grisea (isolate) 17


3.5.1.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm . 17


3.5.1.2. Ly trích DNA theo phương pháp lysis 18


3.5.1.3. Phương pháp tinh sạch DNA 18


3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 18


3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp 18


3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi


khuẩn E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của


Sambrook và cộng sự, 1989) 19


3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp . 19


3.5.2.4.Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit . 21


3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid . 22


3.5.4. Tạo mẫu lai 22


3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng


enzyme cắt giới hạn . 23


3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 23


3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng


phương pháp mao dẫn hướng lên 24


3.5.4.4. Làm khô màng . 25


3.5.4.5. Cố định DNA lên màng 25


3.5.5. Lai southern 26


3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai . 26


3.5.5.2. Rửa màng sau khi lai 26


3.5.5.3. Phát hiện kết quả trên phim X-ray 27


4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28


4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. . 28


4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào


vi khuẩn E.coli DH5α 30


4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea


bằng enzym cắt giới hạn 31


4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi được cắt bằng


EcoRV và BamHI với probe SB . 33


5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 38


5.1. Kết luận . 38


5.2. Đề nghị . 38


TÀI NIỆU THAM KHẢO 49