Luận Văn Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật đông khô và ứng dụng vào bảo quản chủng vi sinh vật

Đồ án tốt nghiệp
Đề tài: Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật đông khô và ứng dụng vào bảo quản chủng vi sinh vật


mơc lơc
trang
MỞ ĐẦU .1
PHẦN THỨ NHẤT – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
I.KỸTHUẬT ĐÔNG KHÔ 3
1.1. Lịchsửra đờicủa kỹ thuật đông khô 4
1.2. Nguyênlý đông khô . 4
1.2.1. Sự thăng hoa 4
1.2.2. Chân không. 6
1.2.3. Áp suất bayhơi 6
1.2.4. Áp suất chân không .7
1.2.5. Áp suất an toàn 7
1.2.6 Áp suất báo động 8
1.2.7. Các tá chất sửdụng trong đông khô 9
1.3. Các giai đoạn của quá trình đông khô 9
1.3.1. Giai đoạn làm đông 9
1.3.2. Giai đoạn làm khô 15
PHẦN THỨHAI - ĐỐITƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 21
I. Đốitượng . 21
1.1. Máy đông khô Epsilon2-6 D, hãng Christ 21
1.2. Chủng vi sinhvật 21
II. Vật liệu 21
2.1 Dơng cơ, m¸y mc 21
2.2. M«i tr-ng, ha cht, dung dÞch . 22
2.3. Tá ch ất sửdụng trong đông khô .
III. Phương pháp nghiêncứu . 22
3.1. M« h×nh nghiªn cu 22
3.2 Thời gian nghiêncứu. 22
3.3. Mô hình nghiêncứu. . 22
3.4 Ph-¬ng ph¸p kiĨm tra ® sng 23
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
3
3.5. Ph ương pháp đông khô chủng 24
3.6. ph ương phápkiểm tra độ ẩmtồndư. . 26
3.7. ph ương phápkiểm tra chân không. . 26
3.8. Ph-¬ng ph¸pxưlý s liƯu 27
PHẦN BA-KẾT QUẢ 28
A. KẾT QUẢ. . 28
I. Cácthông sốkỹthuậtcủa quy trình đông khô chủngVSV. . 28
1.1. Thời gian đông khô chủng. . 28
1.2. Điểm đông và nhiệt độ đông . 29
1.3. Thay đổi ápsuất, nhiệt độvà hình tháivật lý của sản phẩmtrong quá
trình đông khô . . 30
II. Kết quả kiểmtra ch ất lượng trướcvàsau đông khô chủng. 31
2.1. Độsống của chủng trước và sau đông khô. 31
2.2. Kết quả kiểmtra độ ẩmtồndư. . 32
2.3. Mức độhưhỏng sản phẩm do quá trình đông khô. 33
2.4. Kết quả kiểmtra độchân không sau đông khô. 33
B. BÀN LUẬN. . 34
I. Thông sốkỹthuật trong quá trình đôngkhô. . 34
1.1. Thời gian đông khô. 34
1.2. Điểm đông và nhiệt độsảnphẩm. 35
1.3. Thay đổi ápsuất chân không, nhiệt độsản phẩm và hìnhtháivật lý . 35
1.4. Nút cao suvà nút nhôm. . 36
II. Kết quả đông khôchủng VSV. . 37
2.1. Độsống 37
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
4
2.2. Tá ch ất. 37
2.3. Độ ẩmtồn dư, sản phẩmhỏng với thờigian đông khô. . 38
PHẦN THỨTƯ-KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ 39
A. KẾT LUẬN . 39
1. Các thông sốcủakỹthuật đông khô. 39
2. Đông khô chủng VSV. 39
B. ĐỀ NGHỊ. 40
tµiliƯuthamkh¶o
PHỤLỤC
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
5
MỞ ĐẦU
Đông khô, làmộtkỹ thuật tiên tiến đểbảo quản cácmẫuvật phẩm, được ápdụng
mộtcáchrộng rãi trong nhiều ngành vàlĩnhvực khác nhau như yhọc, công nghệ vi sinh
vật, công nghệ phóngxạhạt nhân, khảocổhọc, nông nghiệp,bảo quản thực phẩm
Càng ngày, đông khô càng được ứngdụng nhờ những đặc tính ưu việtvượt trội, mang
lại hiệu quả kinhtế cao. Nhờsự tiếnbộcủa khoahọckỹ thuật, công nghệ đông khô đã
cósự phát triểnvượtbậc,kỹ thuật đông khô ngày càng hi ện đại, rút ngắn thời gian đông
khô,giảmtỷlệhưhỏngsản phẩm. Chi phívề nhân công giảmbớt đángkể nhờsựtự
động hóa và đơn giản hóa, góp ph ần hạgiáthành s ản phẩm.
Công tácbảo quản chủng giống vi sinhvật cómột ýrấtlớn trong các phòng
nghiêncứu và trong công nghệ vi sinhvật. Việcbảo quản không chỉ đơn thuần giữ
chủngsống, mà phải duy trì được những đặc tính ban đầu, khôngbị thay đổi tính chất.
Vì quan trọng nhưvậy, nhiều nước trên thếgiới đã đưa công tác này lên t ầm cỡquốc gia,
thànhlập các trung tâm giữ giống như American type Culture Collection - ATCC –Mỹ,
National Collection of Type Cultures –NCTC – Anh, Korean Collection of Type
Cultures – KCTC – Hàn Quốc, Japan Collection of microorganisms – JCM – Nh ật
Córất nhiều phương phápbảo quản chủng giống vi sinhvật khác nhau. Tuỳ theomục
đích và thời gianbảo quản mà ta có thể ápdụng các hình thứcbảo quản thíchhợp như:
cấy truyền,bảo quản tronglạnh thông thường, đôngbăng. Đểbảo quản lâu dài thì cách
tốt nhấtlà đông khô.
Ở Việt Nam, đông khô đã được ứngdụngtừ lâu, trong nhiềulĩnhvực khác nhau
như đông khô sữa, chất phóng xạ, thực phẩm và sản phẩm nông nghiệp khác.Trong công
nghệvi sinh v ật, đông khô đượcsửdụng phổbiến để giữnhững chủng quý hiếm
Trong 10năm(1986-1995) phònggốc giống viện Vacxin đã giữ chủng vi khuẩn
đông khô và hình thànhhệ thống lô giống cho việcsản xuất các Vacxintả, thương hàn,
bạchhầu- ho gà –uốn ván đạt tiêu chuẩn quốctế. Các chủng vi sinhvật khácrấtcần
đượcbảo quản lâu dàibằngkỹ thuật đông khô, nhằm duy trì và phát triểnhệ thống
chủng giống phong phú c ủa Viện.
4 chủng vi sinhvậtmới được Trung tâm Kiểm định Quốc gia cungcấp cho Viện
Vacxin để phụcvụ cho công tác kiểm định. Các chủng này cóhồsơ đầy đủ, nhưngsố
lượng mỗi chủng chỉ có 2 ống. Để có đủsốlượng chủng cho nhữngnăm tiếp theo thìcần
nhân chủng vàbảo quản bằng phương pháp thíchhợp.
Vì thế, mà em tiến hành đềtài“ Bước đầutìm hiểukỹ thuật đông khô và ứngdụng vào
bảo quản chủng visinh vật”.
Với haimục tiêusau:
1. Tìm hiểukỹ thuật đông khô
2. Anh hưởngcủa kỹthuật đông khô đến độsống của chủng visinh vật.
Đểthựchiện được mục tiêu trên, cácnội dung cần phải tiến hành nghiêncứu là:
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
6
Nộidung 1: Tiến hành đông khô 4 chủng hiện có tại Tổkiểm vi.
Nộidung 2: Kiểm tra độsống củachủng vi sinhvật trước và sau khi đông khô.
Nộidung 3: Kiểm tra độ ẩm tồn dư sau đông khô.
Nộidung 4: Kiểm tra độchân không sau đông khô.
Trong nghiêncứu, trình độ và kinh nghiệm thựctếcủa em cóhạn, chắc chắn không
tránh kh ỏinhững thiếusót. Kính mong quý Thầy cô đóng góp ý kiếnbổ sung hoặcchỉra
những chỗcần sữa chữa để đồán của em hoàn thiện hơn.
Mộtlầnnữa, em xin chân thànhcảm ơn quý thầy cô đãtạo điều kiện thuậnlợi cho em
hoàn thành tốt đồán này.
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
7
PHẦNTHỨ NHẤT.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ
1.1. Lịchsử đông khô:
Altmann (1890) làm khô các mô ở–20
O
C và chân không để nghiêncứuvềlịchsử,
ông giấu 40 năm sau, khi chếtmớicôngbố
Shackell (1909) là người đầu tiên đông khô thành công ở thực phẩm và huyết
thanh.
Haiông Predtets Chensky (1912) Griorowitch đãlặplại thành công kỹthuật này.
Tival (1927) ở Pháp và Elser (1934) ứngdụngrộng rãi vào công nghệ. Elser
(1935) báo cáovề đông khô huyết thanh.
Flosdorf-Mudd (1935) môt ảrộng rãi phương pháp ởMỹ và Greaves (1939) ở
Anh. Các ông nàyvạch ra khảnăng ứngdụng đông khô huyết thanh cho lâm sàng và
đông khô bổthể (1940).
Stobes(1943) tóm lược lý luận và có nhiềukếtquảnghiêncứu đi sâu vàophương
pháp này.
Đông khô chủng vi khuẩn do Schackell – Hammer (1911) Swift (1921) Brown
(1932) Flosdorf –Mudd (1938) Stamp (1947) Sordelli –Greaves (1944) phát tri ểnkỹ
thuật,chếtạodụng cụvà chọn tádược.
Hêthrington – Craig trong labor Difco (mỹ) ứngdụng đông khô môi tr ường nuôi
cấy thành công (1939- 1940).
B.Gorsy là người dùng máy đông khô huyết thanh và chủng giống vi khuẩn đầu
tiên ở Viện HUMAN (Hungary) vàonăm 1940 với máy Flosdorf –type.
Sau hai thậpkỷ 50-60 phát triểnkỹ thuật đông khôvới nhiềubước tiếnvượtbậc
và xáclập thành lý thuyết công nghệ đến từngchi tiết(Ở Pháp có Rey là người đóng góp
nhiều công sức để ứng dụng đông khô cho th ực phẩm).
Tuy giámáy đông khô và các trang thiếtbị cao, songkỹ thuật đông khô có nhiều
hứahẹn khi ứngdụng đông khô chủng giống VSV, chế phẩm miễndịch, vacxin - huyết
thanh,dược phẩm cao cấp vàcả thựcphẩm quý hiếm nữa.
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
8
1.2. Nguyênlý đông khô
Huyềndịch vi khuẩn được làm đông,nướcsẽ chuyển thẳngtừ trạng tháirắn sang
trạng thái khí và thăng hoa nhờ máy hút chân khôngt ạo ra áp suất thấp ở nhiệt độrất
thấp.[1].
Theo nguyên lý nàyt ế bào vi khuẩn được làm khô màvẫn giữ nguyên hình thái.
Khi hoàn nguyênbằngnướccất hoặcbằngmột dungdịch thíchhợp thìtế bàolại trởlại
trạng tháiban đầu.
1.2.1. Sựthăng hoa [14].
Trong quá trình đông khô thìsản phẩm ở trong môi trường áp suất chân không
(nhỏhơn 6.11 mbar) vàhơinước bay ratừsản phẩmsẽ được ngưngtụtạibềmặt (rất
lạnh)củabộ ngưngtụ (ice condenser).Bộ ngưngtụ hoạt động như máybơmhơinước,
máy bơm chân không để giữáp suất chân không trong khoang.
Nhưng để thăng hoa được thìsản phẩm phải đượccấp nhiệt (theo nguyên lý nhiệt
học thì bayhơi thì thu nhiệt). Khi đông khô vídụ như các bình to đáy tròn thì nhiệt độ
phòng chính làngu ồn nhiệt cungcấp cho s ản phẩm.Nếu đông khô các l ọnhỏtrong khay
thì nhiệt cấp cho sản phẩm làtừ các giá đỡsản phẩm(giá sản phẩm điều khiển đượcnhiệt
độ).
Khoảng 90-99 %lượngnước đượclấy ratừsản phẩm trong quá trình đông khô
chính (main drying),l ượng nước liênkết trongsản phẩm còn lạisẽ được lấy ratrong quá
trình đông khô cuối cùng (final drying) d ưới áp suất chân khôngrất thấp.
1.2.1 Sựthăng hoa
-Nếu áp suất khí quyểnlớnhơn 6.11 mbar vàcố định thì khi thay đổi nhiệt độ,
nướcsẽtồntại ởba trạng thái.
+ lỏng
+ rắn
+ khí
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
9
-Tại áp suất chính xác 6.11 mbar và nhiệt độ0
o
C thìnướcsẽtồntạicả ở ba trạng
tháirắn, lỏng, khí(điểm cắtcủa batrạng thái).
-nếu áp suất nhỏhơn 6.11 mbar thìnướcsẽ chuyển trực tiếptừrắn sang khí và
ngượclạibằng việc thay đổi nhiệt độ (quá trình chuyển trực tiếptừrắn sang khí được
gọi là thăng hoa).
1.2.2. Chânkhông [15]
Định luật khí lý t ưởng p ´ V= m ´Rm
´ T = const.
p =áp suấtkhí (Pa), 10
5
Pa =1 bar
V = thểtích (m
3
)
m= khốilượng (kg)
Rm
= R/M, R:hằng sốkhí lý tưởng =8,314J/mol´ k,
M =kh ối lượng trên mol [g/mol],H2
O = 18
T =nhiệt độ(K)
Vídụ: 1,0 gam đátại áp suất
1,0 mbar, thu được1 m
3
hơi
0,1 mbar, thu được10 m
3
hơi
0,01 mbar, thu được100m
3
hơi
Khi ở áp suất chân khôngrất sâu thìsẽ cómộtlượngrấtlớnhơinướctạo ra, nhưng
không nhất thiết phải giảm nhanhlượngnướctrongmẫu
1.2.3 Ap su ất bay hơi[15]
Ap suất bayhơi làlực bayhơicủamột chấtlỏng. Nóbằng hàmcủa nhiệt độ T và
loại chất, đơnvị là (Pa), 10
5
Pa = 1 bar khi nhiệt độtăng thì áp suất bayhơisẽtăng.
Đường cong áp suất bayhơi miêutảsự chuyển đổi trạng tháirắn,lỏng, khí códạng
logarithmic.[14]


TÀI LIỆUTHAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1.Nguyễn CôngBảy (2004)
Nghiên cứusửdụng 4chủng chuẩnquốctế để kiểm tra độnhạy môi trường trong thử nghiệm
vô trùng.
Luận văn ThạcsĩY học – Trường Đại Học Y Hà Nội, Tr10 –27
2. Nguyễn Lân Hùng, PhạmVăn Ty, Dương Đức Tiến
Vi sinhvậthọc tậpI
Nhà xuấtbản đại học và trunghọc chuyên nghiệp
3. Lê Văn Hiệp (1996)
Đôngkhô các chủng đểsản xuấtVắcxin
Tạp chí sinhhọctập18 –số 2
4. Lê Văn Hiệp (2003)
Công nghệ vi sinh
Khoa đàotạo sau đạihọc – trường đạihọc ĐàLạt, tr. 111,119-121.
5.HồVănHiệp(2002)
Xâydựngquy trình đôngkhô superferon tại việnVắcxinNha Trang
Luận văn tốtnghiệp đạihọc –trường đạihọc Đà Lạt, tr.11,12.
6. Nguyễn Đức Lợi, Phạm Văn Tùy, ĐinhVănThuận. (1995)
Kỹ thuậtlạnh ứngdụng .
Nhà xuấtbản giáo dục, tr. 133-256.
7.Lương Đức Phẩm (1998)
Công nghệ vi sinhvật
Nhà xuấtbản khoahọc và kỹ thuật, tr.440- 448.
8. Lương Đức Phẩm, HồSưởng(1978)
Vi sinhtổnghợp.
Nhà xuấtbản khoahọc và kỹ thuật, tr.440 – 448.
9. RobertL. Gherna
Bảotồnchủng vi khuẩn
PGS-TS. ĐinhHữu Dungdịchtừ nguyên bản tiếng Anh, tr.2-22.
10. Huỳnh Thanh Xuân, Lê ThịMỹDung, Nguyễn CôngBẩy (2003)
Chấtlượng và tính ổn định của VacxinBCG đôngkhô
Tạp chí Yhọcdự phòng,tập VIII,số 6, tr.25-27
11. Nguyễn Thị ThếYến (1999)
Nghiên cứusảnxuất vacxinmẫuchuẩnBạchhầu– Ho gà –Uốn ván
Luận văn tiếnsĩ Yhọc, tr.50 – 53.
TIẾNG ANH
12. Barrow G.I., Feltham R.K.A. (1993)
Cowan and Steel’s manualfor the identification of medical bacteria
Cambridge Universityprees,pp. 57,58,83,87,88,212,239.
13. Bio-rad(2001)
Culture media forclastridium
Indusstrialtechonologiess for microbiological detection,pp. 12,21,57.
14. Christ (2004)
Freeze dryer principle
15. Christ ( 2004)
Freeze drying applications.
16. Chrisst (2004)
Freeze drying basic process control
17. Chung Keel Lee (2003)
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
29
CurrentGMP and Inspections
The Internationl Vaccince Institute- Korea,pp.42-45,58.
18. Chung Keel Lee (2003)
Good manufacturing practice (GMP) and related topic.
Korea Food and Drug Administration .pp.15.40.50.
19. Collins C.H. (1970)
Microorannismsin nature
Butterworths London. pp. 185-188.
20. Collins C.H Beale A.J. (1992)
Safety industrialmicrobiology and biotechnology
Butterworth and Heinemann .pp. 214-216
21. David M. Carlberg (1995)
Microbiology for the non- microbiologist
Interpharm Press.pp. 95-98.
22. Difco (1994)
Dehydrated culture media and ingredients
Product catolog for microbiology.pp.32. 34.46.
23. http:// www. atcc.org.
Production sheetfor ATCC 9341. 10231. 6633.11437.
24. Le Mester M SimatosD Preaud J.M Precausta P.M. (1985)
Factors influencing changes in moisture contentduring storageof free- dried vaccines in
vials.
The InternationalAssociasion of Biological Standardization. pp. 177-183.
25. Michael Wetzstein. Michael Schiesswohl. Christian Herget (1993)
Bacillus subtilis and other gram- positive bacteria
Amercans society for microbiology. Washington. DC pp. 555-564.
26. Sierd Bron. Rob Meima. Jan Maarten van Dijl 91998.
Molecular biology and genetics of bacillus subtilis
American society for microbiology. Washington. DC pp. 392-296
27. Simione F.P.Brown E.M ( 1991)
ATCC Preservation menthods: Free- drying, second edition.
Published by American Type Culture Collection. PP. 1-13.
28. Tortora F. Case ( 1981)
Micrrobiology. An introduction
Holloway University Press. PP. 160-162. 736.
29. UNESCO/ UNEP/ICRO(1984).
Culture Collection environmental microbiology and biotechnology
Micren news No. 6.pp. 55-69.
30. WHO (1978)
Guideline for the preparation and estalishmentof reference materials and reference
reagentsfor biological substances.
WHOTech. Rep. Ser. 135. annex 8.pp. 181-215.
31. WHO(1979)
PDF created with FinePrint pdfFactoryPro trial version http://www.fineprint.com
30
International standards. Reference preparations and reference reagents.
WHOTech. Rep. Ser. 226.annex. 12.pp. 20-24.
32. WHO(1992)
Good manufacturing practicesfor biologycal products
WHOTech. Rep. Ser. 822. annex1.pp. 20-23.
33. Ykio Sahara( 1965)
Basic studies on freezing and freeze- drying
Japan. J. med. Sci. Biol No. 18.pp.19-31.
34. Willis At. (1983)
Clostridium- thespore bearing anaerobes.
Microbiology and immunity. Vol 2. Baltimore. pp. 442-475.