Luận Văn Bước đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó

Tên đề tài: “Bước đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó”

Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa, Khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Thụ tinh trong ống nghiệm là một thành công nổi bậc của ngành công nghệ sinh học sinh sản. Phôi là nguồn nguyên liệu rất quan trọng trong công nghệ tế bào gốc, chuyển gen, tạo dòng, hay trong bảo tồn nguồn động vật quý hiếm và chó cũng là một loài đáng được lưu tâm. Trong đề tài có 3 thí nghiệm được tiến hành: Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trường Fert- TALP và TYH
Kết quả: Tỷ lệ trứng chín khi bổ sung β-mercaptoethanol với 50 àM là 4,88%, 100 àM là 1,65% và đối chứng (0 àM ) là 1,3%. Tỷ lệ trứng nhìn thấy rõ các giai đoạn là 21,64% với nồng độ orcein là 0,75% và 28,19% với nồng độ 1%. Tỷ lệ trứng thụ tinh trên môi trường Fert- TALP là 0,4%, trên môi trường TYH là 0%.

MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG
Lời cảm ơn . iii
Tóm tắt . iv
Mục lục vi
Danh mục các chữ viết tắt x
Danh mục các hình và biểu đồ xi
Danh mục các bảng xii
Chương 1 : MỞ ĐẦU . 1
1.1 Đặt vấn đề . 1
1.2 Mục tiêu . 2
1.3 Yêu cầu . 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Buồng trứng 3
2.1.1 Vị trí, hình thái 3
2.1.2 Cấu tạo . 3
2.1.3 Chức năng . 3
2.2 Nang noãn 4
2.2.1 Đặc điểm hình thái 4
2.2.2 Sự phát triển của nang noãn 4
2.2.3 Nội tiết nang tăng trưởng 6
2.2.4 Sự trưởng thành của nang noãn . 7
2.2.4.1 Trưởng thành nhân 7
2.2.4.2 Trưởng thành tế bào chất 8
2.2.5 Sự rụng trứng 9
2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation - IVM) 9
2.3.1 Lịch sử IVM 9
2.3.2 Môi trường IVM 10
vii
2.3.2.1 Các loại môi trường IVM . 10
2.3.2.2 Thành phần trong môi trường IVM 10
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả IVM . 12
2.3.3.1 Thời gian . 12
2.3.3.2 Chất lượng noãn và kích thước nang noãn . 13
2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái . 13
2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng 13
2.4 Phó tinh hoàn . 13
2.5 Tinh trùng 15
2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng . 15
2.5.2 Quá trình sinh tinh . 16
2.5.3 Cấu tạo . 16
2.5.4 Thành phần 17
2.5.5 Đặc tính sinh lý . 17
2.5.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của tinh trùng . 18
2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) 19
2.6.1 Lịch sử IVF . 19
2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh . 20
2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi 21
2.6.4 Vật liệu cho IVF . 22
2.6.4.1 Giao tử 22
2.6.4.2 Môi trường IVF . 22
2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro 23
2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh . 24
2.6.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến IVF . 25
Chương 3: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 26
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 26
3.2 Nội dung nghiên cứu . 26
3.3 Vật liệu . 26
viii
3.3.1 Nguồn mẫu 26
3.3.2 Hóa chất . 27
3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng . 27
3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng 29
3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh . 30
3.3.3 Dụng cụ - thiết bị . 31
3.3.3.1 Dụng cụ . 31
3.3.3.2 Thiết bị 31
3.4 Bố trí thí nghiệm . 32
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng . 32
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình
nhuộm trứng . 32
3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trường Fert-TALP và TYH 32
3.5 Phương pháp tiến hành 33
3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ 33
3.5.2 Xử lý buồng trứng . 35
3.5.3 Tìm và rửa trứng . 35
3.5.4 Phân loại trứng trước khi nuôi 35
3.5.5 Nuôi trứng . 36
3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi 36
3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi . 36
3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi 37
3.5.7 Nhuộm trứng . 38
3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ 39
3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng . 39
3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng 39
3.5.9.2 Các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro: . 39
ix
3.5.10 Phương pháp thụ tinh 40
3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trường Fert-TALP 41
3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trường TYH 42
3.6 Xử lý số liệu 42
Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 43
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả nuôi trứng khi bổ sung các nồng độ β-mercaptoethanol . 43
4.2 Thí nghiệm 2 : Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng 44
4.3 Thí nghiệm 3 : So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trường TYH và Fert - TALP . 47
4.4 Một số kinh nghiệm trong IVF . 48
4.4.1 Lấy mẫu . 48
4.4.2 Thao tác trong phòng thí nghiệm . 49
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 50
5.1 Kết luận 50
5.2 Đề nghị . 50
x

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG
Hình 2.1. Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng . 6
Hình 2.2. Các giai đoạn phát triển của nhân 8
Hình 2.3. Nang noãn trưởng thành . 9
Hình 2.4. Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng . 20
Hình 2.5. Các giai đoạn phát triển của phôi . 21
Hình 3.1. Buồng trứng . 26
Hình 3.2. Tinh hoàn . 27
Hình 3.3. Phó tinh hoàn 27
Hình 3.4. Thao tác mổ lấy buồng trứng . 35
Hình 3.5. Phân loại trứng trước khi nuôi . 36
Hình 3.6. Phân loại trứng sau khi nuôi . 37
Hình 3.7. Sự giãn nở của tế bào cumulus . 38
Hình 4.1. Các giai đoạn phát triển của trứng nhuộm bằng orcein . 46
Hình 4.2. Trứng nhuộm orcein không nhìn thấy rõ giai đoạn 46
Hình 4.3. Tiền nhân sau 24 giờ 47
Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol 43
Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ trứng được nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein . 45
xii
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Lượng tinh trùng dự trữ trong các phần của phó tinh hoàn . 15
Bảng 3.1. Thời gian mọc răng của chó 34
Bảng 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol 43
Bảng 4.2. Tỷ lệ trứng được nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein . 45
Bảng 4.3. Tỷ lệ hình thành tiền nhân trong TYH và Fert-TALP . 47
Sơ đồ 3.1. Quy trình nhuộm trứng . 38
Sơ đồ 3.2. Quy trình thụ tinh 41