Thạc Sĩ Bước đầu nghiên cứu việc sử dụng nấm mốc để xử lý sinh khối rơm thành các đường để sản xuất ethanol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Hóa Sinh
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
2010

MỞ ĐẦU 1



Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình sản xuất nhiên liệu sinh học . 3
1.1.1. Tình hình trên thế giới và tiềm năng . 3
1.1.2 Tình hình ở Việt Nam và tiềm năng . 4
1.2. Nguyên liệu lignocellulose . 5
1.2.1. Cellulose . 6
1.2.2. Hemicellulose . 8
1.2.3 Lignin 9
1.3. Cơ chất xylan . 10
1.4. Từ sinh khối cellulose thành Ethanol .11
1.5. Đạc điêm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm men Saccharomyces cerevisiae .. 11
1.6. Đạc điêm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm men Pichia stipitis .12
1.7. Đạc điêm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm sơi Trichoderma reesei 13
1.7.1. Mọt số đạc tính hệ enzyme cellulase và xylanase từ Trichoderma reesei
. 13
1.7.2. Mọt số yêu tố ảnh hương đên khả năng sinh enzyme cellulase và enzyme xylanase từ nấm Trichoderma reesei . 16
1.7.2.1. Nguồn cacbon 16
1.7.2.2. Nguồn nitơ . 17
1.7.2.3. Chất hoạt động bề mặt . 17
1.7.2.4. pH và nhiệt độ 18
1.7.2.5. Sục khí . 18
1.7.2.6. Lên men bán rắn . 19
1.8. Các yêu tố ảnh hương đên quá trình thuy phân rơm rạ bơi enzyme cellulase và xylanase từ nấm mốc Trichoderma reesei 19
1.8.1. Anh hưởng của cấu trúc nguyên liệu 19
1.8.2. Anh hưởng của nhiệt độ 19
1.8.3. Anh hưởng của pH 20
1.8.4. Tương tác giưa cơ chất và enzyme 20
1.8.5. Anh hưởng của các chất kiềm hãm . 20
1.9. Chuyên hóa sinh học từ cellulose thành ethanol .20
1.9.1. Vi sinh vật phân hủy 21
1.9.2. Lên men ethanol . 21
1.10. Chuyên hóa sinh học từ xylose thành ethanol và các yêu tố ảnh hương đên quá trình lên men ethanol .. 22
1.11. Kêt quả nghiên cứu ngoài nước 24
1.12. Kêt quả nghiên cứu trong nước 27

Chương 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu 29
2.1.1. Nguyên vật liệu . 29
2.1.1.1. Rơm . 29
2.1.1.2. Vi sinh vật 29
2.1.2. Hóa chất và môi trường 30
2.1.2.1. Hóa chất . 30
2.1.2.2 Môi trường hoạt hóa và nuôi cấy vi sinh vật . 31
2.2 Các phương pháp sử dụng . 32
2.2.1. Phương pháp quan sát hình thái Trichoderma reesei . 32
2.2.1.1. Quan sát đại thể 32
2.2.1.2. Quan sát vi thể . 32
2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái tê bào nấm men Pichia stipitis và
Saccharomyces cerevisae 33
2.2.3 Phương pháp xác định mật đọ bào tử nấm sơi và tê bào nấm men bằng buồng đêm hồng cầu . 33
2.2.4. Phương pháp định lương đường khử 34
2.2.4.1. Nguyên tắc . 34
2.2.4.2. Xây dựng đường chuẩn 34
2.2.4.3. Phương pháp đo mẫu thí nghiệm 34
2.2.4.4. Tính kết quả . 34
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase và enzyme xylanase
.. 35
2.2.5.1. Nguyên tắc . 35
2.2.5.2. Xây dựng đường chuẩn Glucose/Xylose xác định hoạt tính enzyme .35
2.2.5.3. Phương pháp đo mẫu thí nghiệm 36
2.2.5.4. Tính kết quả hoạt tính enzyme cellulase và xylanase 37
2.3. Phương pháp nghiên cứu . 38
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm . 37
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm . 37
2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm . 38
2.3.4. Khảo sát hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm 38
2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy phân rơm . 39
2.3.6. Thủy phân rơm rạ trong bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ
BTM, pH và chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm . 39
2.3.7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis 40

Chương 3: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN

3.1. Khảo sát ảnh hương cua yêu tố thời gian đên hàm lương đường khử tạo ra trong quá trình thuy phân rơm . 42
3.1.1 Theo dõi sự thay đổi pH trong quá trình thủy phân .42
3.1.2. Hàm lượng đường khử theo thời gian . 43
3.1.3. Hoạt tính enzym cellulase . 45
3.1.4. Hoạt tính enzym xylanase . 46
3.1.5. Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm .48
3.2. Khảo sát ảnh hương cua mật đọ bào tử mốc đên hàm lương đường khử trong quá trình thuy phân rơm 50
3.2.1. Hàm lượng đường khử theo các kiểu mật độ bào tử mốc .50
3.2.2. Hoạt tính enzym cellulase và xylanase 51
3.2.3. Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm .52
3.3. Khảo sát ảnh hương cua yêu tố pH ban đầu đên hàm lương đường khử trong quá trình thuy phân rơm 52
3.3.1. Hàm lượng đường khử .52
3.3.2. Hoạt tính enzyme cellulase 52
3.3.3. Hoạt tính enzyme xylanase .54
3.3.4. Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm .55
3.4. Khảo sát hàm lương đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thuy phân rơm 56
3.4.1. Hàm lượng đường khử .56
3.4.2. Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase . 57
3.4.3. Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm . 58
3.5. Khảo sát ảnh hương cua chất hoạt đọng bề mạt lên quá trình thuy phân rơm 58
3.5.1. Hàm lượng đường khử 58
3.5.2. Hoạt tính enzyme cellulase và xylanase . 59
3.5.3. Hiệu suất phản ứng thủy phân rơm . 61
3.6. Thuy phân rơm rạ trong bình lên men với các điều kiện thời gian, mật đọ bào tử mốc, pH và chất hoạt đọng bề mạt đã chọn ơ các thí nghiệm trên 61
3.6.1. Hàm lượng đường khử 62
3.6.2. Hoạt tính cellulase và xylanse . 62
3.7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức đọ khác nhau với chung Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis 63

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận 66
4.2 Đề nghị 66


TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Danh mục thiết bị và dụng cụ
Phụ lục 2. Phương pháp phân tích
Phụ lục 3. Kết quả xử lý thống kê


DANH MỤC CÁC BẢNG



Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rơm rạ . 6
Bảng 1.2. Đặc tính sinh hóa của enzyme xylanases từ Trichoderma reesei .16
Bảng 1.3: Con đường vận chuyển xylose ở một vài loài vi khuẩn và nấm men 22
Bảng 2.1: Tóm tắt quá trình dựng đường chuẩn glucose .34
Bảng 2.2: Các bước tiến hành đo mẫu thí nghiệm 35
Bảng 2.3: Tóm tắt quá trình dựng đường chuẩn glucose/xylose 36
Bảng 2.4: Các bước của quá trình xác định hoạt tính cellulase và xylanase 36
Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm lên men ethanol . 41
Bảng 3.1: Hàm lượng đường khử theo thời gian . 43
Bảng 3.2: Hoạt tính enzym cellulase 45
Bảng 3.3: Hoạt tính enzym xylanase . 47
Bảng 3.4: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm rạ .48
Bảng 3.5: Hàm lượng đường khử được tạo ra theo mật độ bào tử mốc 50
Bảng 3.6: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase 51
Bảng 3.7: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm rạ .52
Bảng 3.8: Hàm lượng đường khử tạo ra tương ứng với các giá trị pH ban đầu hác nhau trong quá trình thủy phân rơm .53
Bảng 3.9: Hoạt tính enzym cellulase 53
Bảng 3.10: Hoạt tính enzyme xylanse . 55
Bảng 3.11: Hiệu suất thủy phân rơm ở các điều kiện pH khác nhau 55
Bảng 3.12: Hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate . 56
Bảng 3.13: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate 57
Bảng 3.14: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm rạ .58
Bảng 3.15: Hàm lượng đường khử tạo ra khi bổ sung và không bổ sung
Tween- 80; 0,1% 59
Bảng 3.16: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween 80; 0,1% 59
Bảng 3.17: Hiệu suất của quá trình thủy phân rơm .61
Bảng 3.18: Hàm lượng đường khử 62
Bảng 3.19: Hoạt tính enzym cellulase và xylanase . 63
Bảng 3.20: Kết quả nồng độ ethanol . 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức hóa học của cellulose . 6
Hình 1.2: Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain . 7
Hình 1.3: Công thức hóa học của hemicellulose . 8
Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin . 9
Hình 1.5: Công thức hóa học của lignin .10
Hình 1.6: Vị trí phân cắt của hệ enzyme phân giải cellulose 15
Hình 1.7: Vị trí cắt của hệ enzyme phân giải xylan 16
Hình 1.8. Công thức cấu tạo Tween 80 17
Hình 1.9: Lên men ethanol từ xylose 23
Hình 2.1. Nguyên liệu rơm được xử lý sơ bộ . 29
Hình 2.2. Nấm mốc Trichoderma reesei VTT-D-8013 .30
Hình 3.1: Đồ thị biểu diên sự thay đổi pH ở các mốc thời gian thí nghiệm .42
Hình 3.2: Đồ thị biểu diên hàm lượng đường khử tạo ra theo thời gian .44
Hình 3.3: Sự biến đổi hoạt tính cellulase theo thời gian .46
Hình 3.4: Sự biến đổi hoạt tính xylanase theo thời gian 47
Hình 3.5: Đồ thị biểu diên hiệu suất quá trình thủy phân rơm 49
Hình 3.6: Biểu đồ biểu diên hoạt tính cellulase, xylanase theo mật độ bào tử mốc
51
Hình 3.7: Biểu đồ biểu diên hoạt tính enzym cellulase và xylanase tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate .57
Hình 3.8: Biểu đồ biểu diên enzyme cellulase và xylanase tạo ra khi bổ sung và không bổ sung Tween 80; 0,1% . 60




MỞ ĐẦU


Sự thay đổi khí hậu, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên có giới hạn và nhu cầu sử dụng năng lượng toàn cầu tăng là một vấn đề cần quan tâm cấp thiết. Nhu cầu năng lượng toàn cầu tăng 50% vào năm 2025 và sự tăng trưởng kinh tế một cách nhanh chóng của các quốc gia thuộc Châu Á như Ấn độ, Trung Quốc. Để đáp ứng lại sự tăng trưởng kinh tế vào thế kỷ 21, chúng ta cần cố gắng hơn nữa việc nghiên cứu và sản xuất năng lượng sinh học từ nguồn nguyên liệu tái tạo, chi phí thấp và nguyên liệu có sẵn tại địa phương như chất thải sinh học và các phần còn lại từ nông nghiệp. Sự nỗ lực này không những làm giảm sự ô nhiễm môi trường, mà còn giảm việc khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt. Phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học hiện nay có giá thành rất cao, tuy nhiên, vì mục đích bảo vệ môi trường và phát triển bền vững nên sử dụng nhiên liệu sinh học. Công nghệ sinh học về lên men là một trong những kỹ thuật mà có thể ứng dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulosic, sẽ giúp chúng ta đạt được mục tiêu giữ được môi trường và nguồn năng lượng sử dụng.

Đứng trước những nguy cơ thiếu hụt về nguồn nhiên liệu hóa thạch như dầu mỏ, than đá và cũng là mối quan tâm hàng đầu hiện nay, vì vậy nội dung và phạm vi của đề tài là “Bước đầu nghiên cứu việc sử dụng nấm mốc để xử lý sinh khối rơm thành các đường để sản xuất ethanol” sẽ góp phần vào việc nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu tái tạo được để sản xuất ethanol sinh học phục vụ cuộc sống bền vững
Đề tài được thực hiện qua những nội dung như sau:

A. Giai đoạn 1: Sử dụng nấm mốc để thủy phân rơm rạ thành đường.

1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm.
2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm.
3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm.
4. Khảo sát hàm lượng đường khử tạo ra khi sử dụng và không sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm.
5. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy phân rơm.
6. Sử dụng bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ bào tử mốc, pH và chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm trên.
B. Giai đoạn 2: Lên men ethanol từ các đường được tạo ra
7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis

Nội dung và kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở cho việc ứng dụng công nghệ lên men trong quá trình lên men sinh khối lignocellulosic. Từ những kết quả nghiên cứu của đề tài với qui mô phòng thí nghiệm sẽ phát triển thành kỹ thuật ứng dụng cho các mô hình sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulosic qui mô lớn hơn, đáp ứng việc sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học từ nguồn nguyên liệu tái tạo để phục vụ đời sống.