MỞ ĐẦU Dược liệu luôn chiếm một phần quan trọng trong nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc nhưng hiện nay việc tiêu chuẩn hoá dược liệu còn phức tạp. Một số dược liệu quý hiếm thường hay bị tráo hoặc trộn thêm dược liệu rẻ tiền vì mục đích lợi nhuận, gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm. Trong bối cảnh ngành Dược đang xây dựng tiêu chuẩn GMP cho các nhà máy sản xuất dược phẩm thì vấn đề tiêu chuẩn hóa nguyên liệu thuốc đặc biệt là dược liệu trở nên cấp bách hơn bao giờ hết. Một trong những nguồn dược liệu quý là sâm. Từ “sâm” được dùng để chỉ cây Nhân sâm (Panax ginseng C. A. Meyer). Nó còn được mở rộng để chỉ một số loài cùng chi Panax, họ Nhân sâm (Araliaceae) có tác dụng tương tự Nhân sâm là sâm Mỹ, sâm Tam thất, sâm Việt Nam Nhân sâm đã được biết đến từ lâu với tác dụng hồi phục sự suy giảm chức năng, đưa mọi hoạt động của cơ thể trở lại bình thường, mà y học cổ truyền gọi là “hồi dương”. Hiệu quả tác dụng cũng như giá thành của từng loại khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc, độ tuổi, điều kiện thu hái hoang dại hay nuôi trồng. Do vậy việc xác định đúng nguồn dược liệu để làm thuốc là hết sức quan trọng. Các phương pháp kiểm nghiệm bằng vi thể, sắc ký vân tay được ứng dụng để xác định dược liệu nhưng chưa đủ để xác định được đúng loại sâm, do đó cần phải có phương pháp để giải quyết triệt để vấn đề này. Ngày nay, sự phát triển của kỹ thuật di truyền, kỹ thuật sinh học phân tử, định danh DNA đã thể hiện tính ưu việt so với các phương pháp cổ điển. Do DNA là nhân tố quyết định sự khác biệt giữa các loài nên DNA được xem là căn cứ triệt để nhất trong việc định danh hay xác định các sinh vật. Gần đây, các cơ quan cung cấp chủng như ATCC (American Type Culture Collection), NCTC (National Collection of Type Cultures), đã bắt đầu dựa trên DNA để định danh, phân biệt các chủng mà họ cung cấp. Từ thực tiễn trên, để góp phần xây dựng nền tảng giúp cho việc xác định nguồn sâm dược liệu, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân biệt một số loài Sâm thuộc chi Panax”, nhằm đưa ra các tiêu chí điểm chỉ DNA trong hồ sơ nguồn nguyên liệu để góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu bên cạnh các tiêu chuẩn khác của dược liệu, từ đó xây dựng quy trình xác định Nhân sâm nhằm mục đích đáp ứng cho việc thu mua nguyên liệu và kiểm nghiệm. MỤC LỤC MỤC LỤC i CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC HÌNH .vi MỞ ĐẦU .1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tổng quan về chi Panax .3 1.1.1 Đặc điểm . 3 1.1.2 Phân loại 4 1.1.3 Thành phần hóa học 6 1.1.3.1 Hợp chất saponin 6 1.1.3.2 Hợp chất polyacetylen 8 1.1.4 Tác dụng dược lý 10 1.2 Hệ thống học mức phân tử của Panax .13 1.3 Các phương pháp phân biệt loài dựa trên DNA 13 1.3.1 Các phương pháp dựa trên PCR . 14 1.3.1.1 PCR-Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) . 14 1.3.1.2 Đa hình chiều dài đoạn DNA nhân bản (AFLP) . 14 1.3.1.3 PCR mồi ngẫu nhiên (RP-PCR) 15 1.3.1.4 Vi vệ tinh khuếch đại ngẫu nhiên (RAMS) . 16 1.3.2 Các phương pháp dựa trên sự lai 17 1.3.3 Các phương pháp dựa trên giải trình tự 18 1.4 Chiết tách, phân tích sơ bộ DNA .18 1.4.1 Chiết tách DNA 18 1.4.2 Các phương pháp phân tích sơ bộ axit nucleic 19 1.4.2.1 Đo quang phổ 19 1.4.2.2 Điện di 20 Chương 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 Vật liệu .23 2.1.1 Đối tượng . 23 2.1.2 Dụng cụ, vật liệu - hóa chất . 24 2.1.3 Mồi . 25 2.1.4 Trang thiết bị- dụng cụ . 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng . 26 2.2.2 Chiết tách DNA 26 2.2.3 Phát hiện DNA: Phương pháp điện di gel agarose 28 2.2.4 Thực hiện các phản ứng PCR 28 2.2.4.1 Thiết lập RAMS . 29 2.2.4.2 Thiết lập ITS . 29 2.2.4.3 Thiết lập 18S . 30 2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR . 30 2.2.6 Thực hiện RFLP . 30 2.2.7 Giải trình tự 31 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .32 3.1 Các mẫu Panax .32 3.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng 33 3.3 Chiết tách DNA 34 3.4 Kết quả PCR .35 3.4.1 Vùng ITS 35 3.4.2 Vùng 18S . 35 3.5 Kết quả giải trình tự 36 3.5.1 Vùng ITS 36 3.5.2 Vùng 18S . 37 3.6 Phân tích RFLP 40 3.6.1 Vùng ITS 40 3.6.2 Vùng 18S . 41 3.7 Phân tích RAMS .43 3.7.1 Xác lập điều kiện tiến hành 43 3.7.1.1 Lựa chọn mồi và nhiệt độ gắn mồi thích hợp . 43 3.7.1.2 Dò tìm nồng độ Mg2+ thích hợp . 44 3.7.2 Tiến hành RAMS . 44 3.7.3 Phân tích bằng Bionumeric 45 Chương 4. BÀN LUẬN 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49
