Thạc Sĩ Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC-A-112

Luận văn thạc sĩ
Đề tài: Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126

MỤCLỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNGQUAN TÀILIỆU 3
1.1. Tổng quan về enzyme và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật . 3
1.1.1. Tổng quan về enzyme . 3
1.1.2. Sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 12
1.2. Tổng quan vềchitosanase và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật . 20
1.2.1. Địnhnghĩa 20
1.2.2. Phân loạienzyme chitosanase . 21
1.2.3. Khả năng sinh tổng hợp chitosanase của vi sinh vật 22
1.3. Tổng quan vềchitin, chitosan, glucosamine . 25
1.4. Giớithiệuvềxạkhuẩnvà khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase 27
Chương 2. ĐỐITƯỢNG, VẬT LIỆU VÀPHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU . 33
2.1. Đốitượngvà vật liệu nghiên cứu . 33
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 33
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu . 34
2.2. Phương phápnghiên cứu 34
2.2.1. Xác địnhhoạttínhenzyme chitosanase . 34
2.2.2. Xác địnhhàmlượng đườngglucosamine 34
2.2.3. Xác địnhhàmlượngprotein hòatan 35
2.2.4. Xác địnhsốlượngtếbào .35
2.2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứunuôi cấyvàthu nhậnenzyme chitosanase từ
Streptomycesgriseus VTCC -A -1126 35
2.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định điềukiện ảnh hưởng đến hoạt độ của chitosanase 40
2.2.7. Áp d ụng thủy phân chitosan bằng en zyme chitosanase từ Streptomyces griseus
VTCC-A-1126 41
2.3. Cácthiếtbịthínghiệm chủyếu đãsửdụng 41
2.4. Phương phápxửlýsốliệu 41
Chương 3. KẾTQUẢNGHIÊN CỨUVÀTHẢOLUẬN 42
3.1. Xác định nguồn cacbon nuôi cấy Streptomyces griseusVTCC-A-1126 để thu sinh
khối tế bào 42
5
3.2. Xác định thời gian thu nhận sinh khối thích hợp 44
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứn g -chitosan -trong môi trư ờng nuôi cấy
đến khả năng sinh tổng hợp enzy me chitosanase của Streptomyces griseus VTCC-A-1126 . 45
3.4. Xác định thời gian nuôi sinh chitosanase thích hợp 47
3.5. Ảnh hưởng của loại tác nhân kết tủa đến hoạt độ chitosanase . 48
3.6. Ảnh hưởng của nồng độ (%) aceton đếnhoạt độ chitosanase . 49
3.7. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase . 50
3.7.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độCPEchitosanase . 50
3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase . 52
3.8. K ết q uả sử dụng chế phẩm enzyme chit osanase để thủy phân dung dịch
chitosan 1% 53
3.9. Quy trình thu ch ế phẩm chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC -A -1126 56
KẾTLUẬNVÀ ĐỀXUẤT ÝKIẾN 58
TÀILIỆUTHAM KHẢO . 60
PHẦNPHỤLỤC

MỞ ĐẦU
Chitin, chitosan là polymer h ữu cơ phổ biến trong thi ên nhiên. Trong đ ộng vật
thủy sản đặc biệt l à trong v ỏ tôm, cua, ghẹ, h àm lượng chitin chiếm tỷ lệ khá cao , từ
14-35% so với trọng lượng chất khô. Chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang
được ứng dụng rộng r ãi trong nhi ều lĩnh vực nh ư trong nông nghi ệp, trong công
nghiệp dệt, c ông nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm , mỹ phẩm, y –dược, .Do đó,
việc nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan v à các d ẫn xuất của chúng đang l à v ấn đề
được quan tâm nghiên cứu.
COS (Chitin/Chitosan -Olygosaccharide) là s ản phẩm thủy phân của chitin,
chitosan, chúng là nh ững chất có hoạt tính sinh học cao. Chúng có tác dụng điều h òa
lượng cholesterol, điều h òa áp suất trong máu, l àm tăng khả năng hấp thụ canxi, thúc
đẩy quá tr ình bài ti ết axit uric, chống ung th ư, trị được bệnh viêm loét d ạ dày, chuột
rútvà có kh ả năng l àm tăng s ức đề kháng cho cây trồng. Do vậy, chúng đ ược ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực như Y-dược, Nông nghiệp, Công nghệ Thực phẩm, .
Hiện nay, tại Đại học Nha Trang GS.TS. Trần Thị Luyến v à các c ộng sự đ ã
nghiên cứu sản xuất COS bằng phương pháp hóa học (thủy phân chitin, chitosanbằng
axit HCl đậm đặc) hoặc thu COS bằng ph ương pháp sinh h ọc (dùng các enzyme như
papain, hemicellulase, cellula se đ ể thủy phân chitin, chitosan) [10], [15], [ 20]. Vi ệc
thủy phân chitin, chitosan bằng axit đậm đặc có nhiều nhược điểm như chi phí tốn kém,
hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, hao mòn máy móc thiết bị và sản phẩm có hoạt
tính không cao. Do đó, vi ệc nghiên cứu sản xuất COS bằng ph ương pháp sinh h ọc là
một hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiệnphản ứng nhẹ nhàng, ít gây ô nhiễm môi
trường và sản phẩm có chất lượng tốt.
Vì vậy đề tài "Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ
thuật từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126"là cần thiết, CPE chitosanase n ày được
sử dụng thay thế cho axit HCl đ ậm đặc để thủy phân chitosan t hu COS có chất l ượng
tốt, đồng thời hạn chế ô nhiễm môi trường và hao mòn máy móc thiết bị.
Mục đích của luận văn:
Bước đầu nghi ên cứu các điều kiện thích hợp để thu nhận chế phẩm enzyme
chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126.
11
Nội dung nghiên cứu của luận văn:
-Nghiên cứu một số điều kiện thích hợp cho quá tr ình nuôi c ấy Streptomyces
griseus VTCC-A-1126.
-Nghiên c ứu thu nh ận chế phẩm enzyme kỹ thuật từ Streptomyces griseus
VTCC-A-1126.
-Xácđịnh một số đặc tính của enzymenày (nhiệt độ thích hợp, pH thích hợp).
Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận văn
- Đưa ra đư ợccác đi ều kiện thích hợp cho quá tr ình nuôi c ấy v à thu nh ận
enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126.
- Từ enzyme chitosanase n ày có thể được dùngđể sản xuất COS bằng ph ương
pháp sinh học.
- Làm phong phú thêm nguồn tài liệu khoa học về lĩnh vực nghi ên cứu enzyme
từ VSV nói chung v à enzyme chitosanase từ Streptomycesgriseus VTCC-A-1126nói
riêng, bổ sung vào tài liệu phục vụ giảng dạy và nghiên cứu.
12
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUANVỀ ENZYME VÀ SIN H TỔNG HỢP ENZYME CỦA VI
SINH VẬT [3], [19]
1.1.1. Tổng quan về enzyme
Hầu hết các phản ứng hóa học xả y ra trong tế bào sống đều do enzyme xúc tác.
Enzyme là nh ững protein có khả năng xúc tá c đặc hiệu cho các phản ứng hó a học.
Chúng không những có khả năng xúc tác cho các ph ản ứng xảy ra trong tế b ào sống
mà sau khi tách khỏi tế bào chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng hóa học. Mặt
khác, enzyme còn có hoạt lực xúc tác cao gấp hàng trăm hàng ngàn lần so với các chất
xúc tác vô cơ thông thường [3], [19].
Ví dụ: trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng enzyme saccharaselàm
chất xúc tác th ì tốc độ phản ứng tăng nhanh gấp 2.10
12
lần khi sử dụng axit l àm chất
xúc tác. Quan tr ọng hơn, enzyme còn có khả năng xúc tác cho các phản ứn g hóa học
xảy ra trong những điều kiện bình thường về nhiệt độ, pH. Trong khi các chất xúc tác
vô cơ không có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học thì enzyme lại có
khả năng xúc tác đặc hiệu cao đố i với kiểu phản ứng cũng nh ư đối với cơ chất mà nó
tác dụng.
Ví dụ: axit chlohydric không có tính đ ặc hiệu nên có thể xúc tác thủy phân các
liên kết peptit có trong protein cũng như liên kết glucosid có trong tinh bột.Proteaselà
enzyme chỉ thủy phân đặc hiệu các li ên k ết peptid m à không phân c ắt được liên k ết
glucosid trong tinh bột, amylaselại chỉ có khả năng cắt li ên k ết glucosid của tinh bột
mà không cắt được liên kết peptid của protein.
Do những ưu điểm trên mà ngày nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme càng
có ý nghĩa về mặt lý thuyết cũng như thực tiễn.
Enzyme là những protein có khối l ượng phân tử lớn, đa số có khối lượng phân
tử trung bình từ 6.000-1.000.000 dalton.
Enzyme hòa tan trong n ước, trong dung dịch muối lo ãng, trong các dung d ịch
đệm tạo thành dung dịch keo và enzyme không tan trong dung môi không phân cực
13
Enzyme cũng bị kết tủa bởi các tác nhân gây kết tủa protein. Các tácnhân vật lý
và hóa học làm biến tính protein thì cũng làm biến tính enzyme vì v ậy enzyme cũng bị
mất hoạt tính khi bị tác động b ởi các tác nhân gây biến tính protein như nhiệt độ cao,
axit hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng.
Enzyme đư ợc cấu tạo bởi các L -α-axit amin k ết hợp với nhau qua li ên k ết
peptid. Các k ết quả nghiên cứu cho thấy enzyme cũng bị thủ y phân dưới tác dụng của
cácpeptid-hydrolase, axit ho ặc kiềm. Khi enzyme bị thủy ph ân hoàn toàn t ạo thành
các L-α-axit amin trong một số trường hợp ngoại lệ ngoài axit amin còn nhận được các
chất khác.
Enzyme có hai loại: enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần.
- Enzyme một thành phần thì chỉ có phần protein, những enzym e này thường xúc
tác cho phản ứng thủy phân.
- Enzyme hai thành phần gồm có: phần protein v à phần phi protein. Phần protein
gọi là apoenzyme, phần phi protein gọi là coenzyme hay nhóm ngoại.
Phân tử enzyme một th ành ph ần cũng nh ư hai thành ph ần đều chứa protein
nhưng sốchuỗi polypeptid trong phân tử enzyme có thể thay đổi tùy từng enzyme.
Đến nay ng ười ta đã xác định được rằng phần lớn enzyme trong tế bào đều có
cấu trúc bậc bốn bao gồm nhiều tiểu đ ơn v ị, các tiểu đ ơn v ị n ày có th ể liên k ết với
nhau bằng liên kết hydro,liên kết cộng hóa trị hoặc một số liên kết khác.
Trung tâm hoạt động của enzyme l à m ột phần nhỏ trong cấu trúc của enzyme,
quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme. Trung tâm hoạt động củ a enzyme bao gồm
nhiều nhóm chức khác nhau của axit amin, các nhóm chức của coenzyme, phân tử nước
liên k ết và trong nhiều trường hợp có cả ion kim loại. Có những enzyme có một trung
tâm hoạt động nhưng cũng có enzyme có hai hay nhiều trung tâm hoạt động.
Ví dụ: alcohol-dehydrogenasecủa gan động vật có hai trung tâm hoạt động, còn
alcohol-dehydrogenasecủa nấm men có t ới bốn trung tâm hoạt động. Các trung tâm
hoạt động có thể giống nhau, nh ưng cũng có thể khác nhau về cấu tạ o và chức năng.
Enzyme một thành phần chỉ có phần protein do vậy trung tâm hoạt động của nó
là sự phối hợp giữa các nhóm chức tự do của axit amin. Các nhóm chức thường gặp của
các axit amin trong trung tâm hoạt động của enzyme l à: nhóm –SH (sulfuhydryl) của
Cys; nhóm –OH (hydroxyl) của Ser hay Thr hoặc Tyr; nhóm –COOH (carboxyl) của
Asp hay Glu; nhóm ( ε-NH2
) của Lys; v òng imidazol của His; nhóm guanilic của Arg.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bộ Thủy sản (2003), Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, Nhà xu ất bản
nông nghiệp.
2. V ũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá tr ình th ủy phân protein cá bằng enzyme
protease t ừ B. subtilis S5 , Lu ận án tiến sĩ sinh học, Tr ường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công
nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Hữu Hiệp (2006), Giáo trình vi sinh v ật chuyên sâu, Vi ện nghiên cứu v à
phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
5. Đinh Minh Hi ệp, Đồng Thị Thanh Thu, Nguyễn Thụy Dạ Thảo, Phan Anh Tú
(2004), “Nghiên cứu quy trình chiết tách v à ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm
mật Coprinus Fimentarius”, Báo cáo tổng kết nghiệm thu sở Khoa học và Công nghệ,
TP. Hồ Chí Minh.
6. Đ ặng Vă n H ợp (2000), Hoàn thiện quy tr ình công ngh ệ chiết xuất protease từ
Asperigillus oryzae A4
và ứng dụng vào sản xuất nước mắm, Luận án tiến sĩ kỹ thuật,
Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
7. Đinh Duy Kháng, Nông Văn H ải, Trương Nam H ải, Chikafusa Fukazawa (1999),
“Nghiên cứu tinh chế v à xác định tính chất của chitinase từ đậu tương”, Báo cáo khoa
học Hội nghị Công nghệ sinh họctoàn quốc, Hà Nội.
8. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, L ê Văn Vi ệt Mẫn(2003), Thực tập vi sinh vật
học thực phẩm, Trường Đại học Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Đức L ượng, Cao C ường (2003), Thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xu ất bản
Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
10. Tr ần Thị Luyến (số 1 -2003), “Nghiên c ứu sản xuất chitosan bằng enzy me
papain”, Tạp chí Khoa học công nghệ Thủysản, Trường Đại học Thủy sản.
70
11. Trần Thị Luyến (2004), “Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử ngh iệm cấp Bộ sản
xuất chitin, chitosan từ phế liệ u chế biến thủy sản (vỏ tôm, v ỏ ghẹ)”, Trường Đại học
Thủy sản Nha Trang.
12. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, N guyễn Anh Tuấn (2006), Sản xuất các chế
phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
13. Trần Thị Luyến (số 3 -2005), “Nghiên cứu khả năng làm giảm số lượng vi sinh vật
trên bề mặt thịt bò bao gói màng chitosan ph ối trộn phụ liệu”, Tạp chí Khoa học công
nghệ Thủy sản, Trường Đại học Thủy sản.
14. Trần Thị Luyến ( số 1 -2006), “Nghiên cứu sử dụng olygoglucosamin từ chitosan
vỏ tôm, vỏ ghẹ để thay thế NaNO
3
trong bảo quản xúc xích g à surimi”, Tạp chí Khoa
học công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Thủy sản.
15. Tr ần Thị Luyến (2007), “Nghiên c ứu sản xuất COS từ chitin, chi tosan bằng
enzyme”,Báo cáo khoa học đề tài cấp trường, Trường Đại học Nha Trang.
16.Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh h ọc, Nhà xuất bản Khoa học v à Kỹ
thuật, Hà Nội.
17. Đỗ Văn Ninh (2004), Nghiên cứu thủy phân protein cá bằng proteaza nội tạng cá,
mực và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mớitừ protein đ ược thủy phân, Luận án tiến sĩ
kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
18. Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004), Nghiên cứu chiết suất protease từ đầu tôm bạc nghệ
(Metapenaeus brevicornis) và ứng dụng thủy phân cơ thịt cá mối , Luận văn thạc sĩ kỹ
thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
19. Lê Ng ọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Tr ân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982 ),
Enzyme vi sinhvật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
20. Lê Th ị T ưởng (2007), Nghiên c ứu thủy phân chitin, chitosan bằng enzyme
hemicellulase và ứng dụng sản phẩm thủy phân v ào bảo quản sữa t ươi nguyên li ệu,
Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang.
21. Nguyễn Thị Xuyến (1996), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP.Hồ Chí
Minh.
TIẾNG ANH
22. A. Loredo, R. Rodriguez -Herrera, J. C. Montanez, A. V. Charles -Rodríguez
(2005), “Chitosan-oligosaccharides production by endo -chitosanase and their fungal
71
inhibition capacity in corn tortillas ”, Nutraceutical & Functional Fo ods General I ,
Session 35.
23. Chih-Yu Cheng, Chu -Han Chang, Yue -Jin Wu, and Yaw -Kuen Li (2006),
“Exploration of Gly cosyl Hydrolase Family 75, a C hitosanase from Aspergillus
fumigatus”, J. Biol. Chem., Vol. 281, Issue 6, pp. 3137-3144.
24. Edward M. Marcotte, Arthur F . Monzingo, Stephen R. Ernst, Ryszard Brzezinski
& Jon D. Robertas (1996), “X-ray structure of an anti -fungal chitosanase from
Streptomycessp. N17 4”, Structural Biology 3, Department of Chemistry and
Biochemistry University of Texas Austin, Texas 78712, USA.
25. Hong Kyoon No et al (2002) , “Antibacterial activity of chit osans and chitosan
olygomers with di fferent molecular weights ”,International Journal of Food
Microbiology, Volume 74, Issues 1-2, pp. 65-72.
26. Fukamizo T. (2000) , “Chitinolytic enzymes: catalysis, substrate binding, and thei r
application”, Current Protein Peptide Science 1, pp.24-105
27. Jae Kweon Park, Kumiko Shimono , Nobuhisa Ochiai, Kazutaka Sh igeru, Masako
Kurita, Yukari Ohta, Katsunori Tanaka, Hideyuki Matsuda, and Makoto Kawamukai
(1999), Purification, Characterization, and Gene Analysis of a Chito sanase (ChoA)
from Matsuebacter ch itosanotabidus3001, Department of Life Science an d
Biotechnology, Faculty of Life and Environmental Science, Sh imane University,
1060 Nishikawatsu, Matsue, Shimane 690-8504, Japan.
28. Jon D. Robertus, The chitosanase from Streptomycessp. N174 , Universit y of
Texas at Austin.
29. Jun-ichi Saito, Akiko Kita, Yoshik i Higuchi, Yoshiho Nagata, Akikazu Ando, and
Kunio Miki (1999), Crystal Structure of Chitosana se from Bacillus circulansMH-K1
at 1.6 -Å Resolution and Its Substrate Recognition Mechanism , Departm ent of
Chemistry, Graduate School of Science, Kyoto University, Sak yo-ku, Kyoto 606 -8502, Japan and the Department of Bi otechnology, Graduate School o f Science and
Technology, Chiba University, Matsudo-city, 271-8510, Japan, Vol. 274, Issue 43, pp.
30818-30825.
30. JY Masson, I Boucher, WA Neuge bauer, D Ramotar and R Brzezin ski (1995), “A
new chitosanase gene from a Nocardioidessp. is a third member of glycosyl hydrolase
family 46”, Microbiology, Vol 141, pp. 2629-2635.
72
31. Lian –Ying Zheng and Jiang –Feng Zhu (2003), Study on antimicrobial activity of
chitosan with different molecular weight, carbohydrates polymers, Volume 54, Issues1
december 2003, pp. 527 –530.
32. Pozo, MJ; Azcon-Aguila, Dumas-Gaudot, Barea (1998), “Chitosanase and
chitinase activiti es in tomato roots during inte ractions with arbuscular mycor rhizal
fungi or Phytophthora parasitica ”, Journal of Experim ental Botany , Volume
49, Number 327, pp. 1729-1739.
33. R.A.A. Muzzarelli and M.G.Pe ter (1997), Chitin Handbook, eds European Chitin
Society.
TỪ TRANG WEB
34. http://jbc.org/cgi/content/abstract/249/3/811
35. http://jb.asm.org/cgi/content/abstract/178/17/5065
36. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm
37. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan02.htm
38. http://en.wikipedia.org/wiki/Glucosamine
39. http://pages.usherbrooke.ca/rbrzezinski/
(The chitosanase web page-Ryszard Brzezinski and AndrzejNeugebauer-2004)