Thạc Sĩ Bước đầu nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột

Đề tài: Bước đầu nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột

Cộng tác viên: DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AS Adult stem cell Tế bào mầm trưởng thành
D`MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Môi trường D`MEM
dpc day postcoitum Ngày sau giao phối
Ebs Embryonic bodys Thể phôi
EC Embryonic carcinoma Tế bào khối u
EGC Embryonic germ cell Tế bào mầm phôi
ES Embryonic stem cell Tế bào gốc phôi
FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò
FGF Fibroblast growth factor Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi
GC Germ cell Tế bào mầm
ICM Inner mass cell Khối tế bào bên trong
LIF Leukimia inhibitory factor Nhân tố ức chế bạch cầu
MEF Mouse embryonic fibroblast Tế bào fibroblast phôi chuột
MHC Major Histocompatibitity complex Phức hợp tương hợp mô
PGC Primordial germ cell Tế bào mầm sinh dục sơ khai LỜI MỞ ĐẦU
Thế kỷ 21 - với sự bùng nổ của thành tựu Công Nghệ Sinh học đã đem lại
nguồn lợi to lớn cho cuộc sống nhân loại. Con người không ngừng tìm kiếm những
hướng nghiên cứu mới trong Sinh học Phân tử và Sinh học tế bào. Đặc biệt là việc
nghiên cứu tế bào gốc (Stem cell) nhằm tận dụng nguồn giá trị vô tận của loại tế
bào này trong công tác chữa bệnh nhất là bệnh nan y.
“Tế bào gốc” đã trở thành một khái niệm không còn xa lạ trong lĩnh vực YSinh học do những đặc tính ưu việt của nó. Tuy nhiên Công nghệ tế bào gốc (Stem
cell biotech) cũng đã trở thành nỗi băn khoăn cho nhân loại khi nó được nghiên cứu
và thao tác trên chính con người.
Nhiều quốc gia trên thế giới đã cho phép tiến hành các thao tác trên tế bào gốc
phôi người (Human embryo) và cũng có nhiều nước cấm, trong đó có Việt Nam.
Vấn đề này còn đang có nhiều tranh cãi và hiển nhiên sẽ còn bị hạn chế cho đến khi
tìm ra các phương pháp kiểm soát chặt chẽ.
Trong các đối tượng nghiên cứu phổ biến hiện nay, chuột nhắt trắng có lẽ là khá
quen thuộc trong phòng thí nghiệm vì những đặc tính thuận lợi của nó: kích thước
nhỏ, vòng đời ngắn, đặc điểm sinh lý gần với người
Việc thu nhận tế bào gốc từ phôi chuột đã được thực hiện từ rất lâu trên thế giới
và đã đạt được nhiều thành tựu. Tuy nhiên, lĩnh vực nghiên cứu này còn rất hạn chế
ở Việt Nam.
Để bắt đầu tiếp cận với đối tượng nghiên cứu mới này, chúng tôi bước đầu
nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột. Mặc dù bước đầu đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng chắc chắn rằng
còn nhiều điều chưa hoàn thiện. Rất mong sự quan tâm và góp ý của những ai quan
tâm đến vấn đề này để đề tài được hoàn thiện hơn.
Chân thành cảm ơn.
TP HCM, tháng 12/2005
Thay mặt nhóm tác giả
Dương Thị Bạch Tuyết
PHẦN 1 1. TẾ BÀO GỐC
1.1. Khái niệm
Tế bào gốc là một loại tế bào chưa chuyên hoá, có khả năng phân chia vô hạn
trong các tổ chức sống, có nguồn gốc từ phôi, bào thai hay mô cơ thể trưởng thành.
Dưới điều kiện thích hợp hay có tín hiệu kích thích, tế bào gốc sẽ phát triển thành
nhiều loại tế bào chuyên hoá tạo thành các cơ quan hay tổ chức của cơ thể. [1][2]
1.2. Đặc điểm
 Có khả năng phân chia vô hạn.
 Cấu trúc di truyền (Bộ NST lưỡng bội) trong các tế bào vẫn duy trì và ổn
định với mỗi loài.
 Có thể biệt hoá thành các loại tế bào chuyên hoá khác nhau thu từ 3 lớp
mầm nguyên thủy.
 Có khả năng nhân dòng tế bào.[1][2]
1.3. Phân loại
Gồm 2 nhóm chính : [7][9]
 Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ES)
 Tế bào gốc phôi – ES
 Tế bào mầm phôi (Embryonic Germ Cell – EGC)
 Tế bào gốc trưởng thành (Adult Stem Cell – AS)
1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu
Các tế bào gốc phôi (ES _ Embryo stem cell, ) lần đầu tiên được cô lập vào
những năm 1980 bởi nhiều nhóm nghiên cứu làm việc độc lập. Những nhà nghiên
cứu này đã nhận ra đặc tính biệt hóa đa hướng của tế bào ES để cho ra các loại tế
bào của cả ba lớp mầm sơ khởi. Gossler và cộng sự đã miêu tả khả năng và lợi điểm của việc dùng tế bào ES để
tạo ra được các động vật chuyển gene. Thomas và Capechi đã báo cáo về khả năng
biến đổi bộ gene của các tế bào ES bằng tái tổ hợp tương đồng.
Smithies và các đồng nghiệp sau đó đã chứng minh rằng các tế bào ES được biến
đổi gen khi vào Blastocyst, có thể truyền lại những biến đổi di truyền này qua các
dòng tế bào .
Ngày nay các biến đổi di truyền trên bộ gene chuột bằng kỹ thuật tế bào ES là
một cách tiếp cận quan trọng để tìm hiểu chức năng của các tế bào động vật hữu
nhũ in vivo. Các nghiên cứu về các tế bào ES của các động vật hữu nhũ: chuột đồng,
chuột, chồn, heo và bò đã được công bố; tuy nhiên, chỉ có tế bào ES chuột là thành
công trong việc truyền lại các biến đổi di truyền từ tế bào ES thông qua dòng tế bào
mầm sinh dục.
Gần đây, các quan tâm về các tế bào gốc đã tăng mạnh nhờ những báo cáo về
cô lập tế bào ES ở người và linh trưởng.
Các công trình tạo phôi lai giữa người và thỏ, biến tế bào gốc thành trứng và tinh
trùng, thu tế bào mầm mà không làm chết phôi đã thu được nhiều kết quả khả
quan trong hai thập kỷ qua.
Đặc biệt, vào tháng 5/2004 A. Melton và cộng sự đã biệt hoá 17 loại tế bào
khác nhau từ ES thu nhận từ khối tế bào bên trong của blastocyst ở người.
Các nhà khoa học Hàn quốc đã tỏ ra vượt trội và đã có các công trình có tính
tiên phong trong lĩnh vực thu nhận tế bào gốc phôi người.
Tính đến nay, trên thế giới, ít nhất đã có 4 ngân hàng tế bào gốc ra đời và đi
vào hoạt động (Hàn quốc, Anh, Mỹ, Trung quốc). Hình 1.1 : a) Blastocyst b) phôi người giai đoạn 8 tế bào
Riêng ở Việt Nam, việc nghiên cứu tế bào gốc chỉ mới đang trong giai đoạn
khởi đầu và được tập trung chủ yếu tại hai trung tâm lớn (Đại học Khoa học Tự
nhiên Hà nội và Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM). Mặc dầu vậy, các phòng
Thí nghiệm công nghệ cao của hai Trường nói trên cũng đã đạt được một số thành
tựu làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về tế bào gốc. Chẳng hạn như xây dựng
các quy trình thu nhận nguồn phôi in vitro, in vivo từ động vật làm nguyên liệu cho
khai thác tế bào gốc, cấy ghép da thu được từ nuôi cấy tế bào để điều trị các ca
bỏng, ghép tế bào gốc CD34+ máu ngoại vi để để điều trị bệnh lý ác tính, thu tế
bào gốc sinh máu từ tuỷ xương, cuống rốn [7][9]
2. TẾ BÀO GỐC PHÔI
2.1. Khái niệm và đặc điểm
Tế bào gốc phôi được định nghĩa bởi nguồn gốc của nó, chúng có nguồn gốc từ
dạng blastocyst của phôi. Blastocyst là một dạng phát triển tất yếu của phôi trước
khi bám vào thành tử cung. Ở giai đoạn này, phôi chuột gồm lớp tế bào ngoài (ngoại
phôi bì), khoang phôi và khối tế bào bên trong. Tế bào gốc tăng nhanh về số lượng và biệt hóa chức năng thành các cơ quan
trưởng thành. Nếu tách tế bào gốc ra khỏi phôi và chuyển chúng vào một cơ quan
khác hay cơ thể trưởng thành, chúng có thể hòa nhập, tiếp tục phân chia và thể hiện
khả năng chuyên biệt theo cơ quan đó.
Tương tự, nếu các tế bào này được cô lập invitro, tạo dòng (colony) và tác động
biệt hóa, chúng sẽ có khả năng biến đổi hình thái và đặc điểm sinh lý để cho các
dạng tế bào khác trong phòng thí nghiệm.[1][2]
Hầu hết những tế bào trong cơ thể đều có nguồn gốc từ sự tự sao chép tế bào
gốc. Do đó, các nhà khoa học nhận thấy cần phải phát triển đặc điểm đặc biệt này
để giúp tế bào gốc biệt hóa tốt hơn. Austin Smith đã xác định các đặc điểm cụ thể
của tế bào gốc phôi như sau:
 Chuyển hóa từ lớp tế bào bên trong hay nội phôi bì của blastocyst.
 Tồn tại và duy trì ổn định bộ nhiễm sắc thể ở dạng lưỡng bội.
 Có thể phát triển thành các loại tế bào khác nhau và xuất phát từ 3 lớp mầm
riêng biệt của phôi (nội bì, trung bì và ngoại bì).
 Có khả năng hợp thành một thể thống nhất trong tất cả các mô thai trong suốt
thời kỳ phát triển.
 Có khả năng nhân dòng tế bào và phát triển thành tế bào trứng và tinh trùng.
 Biểu hiện nhân tố sao chép Octo-4, làm hoạt hóa hay kìm hãm một gene đích
và duy trì sự phát triển nhanh của tế bào gốc phôi không biệt hóa.
 Có thể tiếp tục phát triển và tự đổi mới chính nó.
 Dòng các tế bào gốc phôi đơn bào có thể phát triển thành dòng tế bào thuần
hay dòng tế bào có nguồn gốc như nhau.
 Trong tổng hợp DNA, khác với tế bào sinh dưỡng, tế bào gốc phôi không đòi
hỏi các tác nhân kích thích bên ngoài khi bắt đầu sao chép DNA.