Thạc Sĩ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của nông nghiệp, hàng năm hàng triệu tấn chất lignocellulose bắt nguồn từ các hoạt động nông nghiệp, được thải ra môi trường. Điều này không chỉ làm tăng thêm gánh nặng môi trường mà còn làm lãng phí về các nguồn sinh khối, do đó cần phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc thải các chất thải vào môi trường. Các phương pháp xử lý hóa học và sinh học thông thường ngày càng khó đạt được mức độ cần thiết để loại bỏ các chất ô nhiễm này. Vì vậy cần phải triển khai những biện pháp xử lý sao cho vừa nhanh hơn, rẻ hơn, hiệu quả hơn, đáng tin cậy hơn vừa đem lại lợi ích kinh tế. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học đã được ứng dụng rộng rãi trong xử lý chất thải nông nghiệp.
Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên dựa trên đường, tinh bột và dầu thực vật, tuy nhiên chưa thực sự có được những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. Lignocellulose được xem là thế hệ nhiên liệu sinh học thứ hai. Đối với môi trường và các ngành kinh tế, các chất thải lignocellulose sẽ được sử dụng như một nguồn nguyên liệu để sản xuất các chất hóa học, nhiên liệu và các vật chất tương hợp khác. Bên cạnh đó, các nguồn nguyên liệu này được đặc biệt quan tâm vì giá thành thấp và nguồn cung cấp dồi dào. Quá trình biến đổi sinh học các chất thải thành nhiên liệu có thể mang đến các lợi nhuận về kinh tế cũng như về môi trường [1].
Lignocellulose (sinh khối thực vật) bao gồm các polysaccharide chủ yếu là cellulose, hemicellulose (xylan) và lignin, trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35% đến 50% khối lượng khô thực vật, còn hai hợp chất, hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20-30% và 5-20% khối lượng khô của cơ thể thực vật [23]. Với tính sẵn có lignocellulose trở thành một nguồn năng lượng tái tạo dồi dào [36].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng và triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học các chất thải lignocellulose để tạo ra các đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3].
Nhằm thu được enzyme có hoạt tính thủy phân lignocellulose hiệu quả thành các đường đơn và đường đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để rồi từ đó đưa vào ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con người, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt”.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. Cấu trúc của lignocellulose 6
1.1.1. Cấu trúc thành tế bào thực vật 6
1.1.2. Cellulose 9
1.1.3. Lignin 11
1.1.4. Hemicellulose 15
1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose 17
1.2.1. Enzyme cellulolytic 18
1.2.2. Enzyme xylanolytic 20
1.3. Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic 22
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
2.1. Nguyên liệu 23
2.1.1. Mẫu đất 23
2.1.2. Hóa chất 23
2.1.3. Thiết bị 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 23
2.2.2. Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt. 24
2.2.2.1. Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 24
2.2.2.2. Tách chiết ADN tổng số 24
2.2.2.3. Định lượng ADN bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 260 nm và 280 nm. 25
2.2.2.4. PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 26
2.2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector p-GEM T 26
2.2.2.6. Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli DH5α 27
2.2.2.7. Đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 28
2.2.3. Thu nhận chế phẩm enzyme 29
2.2.4. Xác định hoạt độ enzyme 30
2.2.4.1. Xác định hoạt độ enzyme 30
2.2.4.2. Ảnh hưởng của pH đối với hoạt độ và độ bền của enzyme 32
2.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ và độ bền của enzyme 32
2.2.5. Xác định protein 32
2.2.6. Thủy phân các chất lignocellulose 32
2.2.7. Tách phức hệ multienzyme từ dịch lỏng của môi trường nuôi cấy 32
2.2.8. Điện di gel và kỹ thuật zymogram 33
2.2.9. Sắc ký bản mỏng (TLC) 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 34
3.1.1. Sàng lọc các vi khuẩn ưa nhiệt kỵ khí bằng môi trường làm giàu và nuôi cấy ở nhiệt độ cao 34
3.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính xylanolytic-cellulolytic 38
3.2. Kết quả nhận dạng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 39
3.2.1. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn 39
3.2.2. Nhận dạng vi khuẩn bằng đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 40
3.2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen của chủng vi khuẩn NKP13 40
3.2.2.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 bằng PCR 41
3.2.2.3. Nhân dòng gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 vào vector pGEM T 42
3.2.2.4. Giải trình tự gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 46
3.3. Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic của chủng NKP13. 48
3.3.1. Khả năng sinh tổng hợp xylase và CMCase 48
3.3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ xylanase và CMCase 50
3.3.2.1. pH phản ứng tối ưu 50
3.3.2.2. Độ bền pH 51
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme xylanase và CMCase và độ bền nhiệt của enzyme 52
3.3.3.1. Nhiệt độ phản ứng tối ưu 52
3.3.3.2. Độ bền nhiệt 52
3.3.4. Khả năng thủy phân nguyên liệu lignocellulose của enzyme 53
3.3.5. Điện di chế phẩm enzyme trên gel polyacrylamide có SDS 55
KẾT LUẬN 57
KIẾN NGHỊ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58