Luận Văn BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI

TÓM TẮT KHÓA LUẬN
NGUYỄN PHƯỚC DOANH, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài “BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RAPD” được tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm và Hóa sinh trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007.
Mắm trắng là loài cây ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trò quan trọng và có sự phân bố rộng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Tuy nhiên, trải qua những hoạt động khai thác của con người, quần thể mắm trắng tại đây ngày càng thoái hóa và suy giảm về diện tích nghiêm trọng. Vì vậy, những nghiên cứu về đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho việc thiết lập các chiến lược tái tạo và phục hồi sự đa dạng sinh học của hệ sinh thái.
Những kết quả đạt được:
 Thu được 50 mẫu lá mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể.
 Tối ưu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lượng cao đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu Sinh học phân tử.
 Bước đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm trắng, sử dụng primer OPAC10. Với 14 mẫu DNA phân tích thu được tổng cộng 49 băng, trung bình là 3,5 băng cho mỗi mẫu. Có 6 băng đa hình ở các kích thước 450 bp, 390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp và chỉ 1 băng đồng hình ở kích thước 200bp.
 Kết quả thực hiện phản ứng RAPD được xử lý trên mần mềm NTSYS thu được cây phân loài của những cây đem phân tích. Cây phân loài cho thấy chỉ số đồng dạng di truyền khá cao từ 0,55 – 1. Điều này cũng có nghĩa sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ở mức thấp do đó cần đặc biệt chú ý đến công tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền trên cây mắm trắng và đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng trong thời gian tới.

MỤC LỤC
ĐỀ MỤC TRANG
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN . iv
SUMMARY v
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG . ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH . x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi
Phần 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục đích . 2
1.3. Yêu cầu . 2
1.4. Giới hạn của đề tài . 2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ 3
2.1.1. Đặc điểm tự nhiên 3
2.1.2. Cấu trúc 6
2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ 7
2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển 9
2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ 9
2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba) . 10
2.2.1. Vùng phân bố . 10
2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng . 11
2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng 13
2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ . 13
2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng 14
vii
2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền . 14
2.3.1. Đa dạng sinh học 14
2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học 14
2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học 15
2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái . 15
2.3.3.2. Đa dạng loài . 15
2.3.3.3. Đa dạng di truyền . 16
2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam 17
2.4. Phương pháp chiết tách DNA thực vật . 18
2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) 19
2.5.1 Khái niệm 19
2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR 19
2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR 20
2.5.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR 21
2.5.5. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR . 21
2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền 22
2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 22
2.6.2. Nhóm dựa trên PCR 23
2.6.2.1. SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) . 23
2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) 24
2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) . 25
2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 30
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM . 33
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành . 33
3.1.1. Thời gian tiến hành . 33
3.1.2. Địa điểm 33
3.2. Vật liệu nghiên cứu 33
3.2.1. Mẫu thực vật . . 33
viii
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 34
3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA . 34
3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA . 35
3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD 36
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 36
3.3. Phương pháp nghiên cứu 37
3.3.1. Phương pháp ly trích DNA . 37
3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích 39
3.3.2.1. Kiểm tra định tính DNA bằng phương pháp điện di trên gel 39
3.3.2.2. Kiểm tra định lượng DNA bằng quang phổ kế 39
3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD . 40
3.3.4. Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 . 42
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 43
4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ . 43
4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu 44
4.3. Kết quả quá trình ly trích DNA tổng số . 44
4.4. Kết quả quá trình thực hiện phản ứng RAPD 47
4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 . 47
4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2 . 50
4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ 50
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54
5.1. Kết luận 54
5.2. Đề nghị . 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56
PHỤ LỤC
ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 3.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 . 40
Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 . 40
Bảng 3.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 41
Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 . 41
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 47
x
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ . 5
Hình 2.2. Cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. . 11
Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. . 12
Hình 2.4. Trái mắm trắng. . 12
Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. . 20
Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI 26
Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. 26
Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. 27
Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. . 28
Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP . 29
Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR 30
Hình 4.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ . 43
Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2 45
Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3. 45
Hình 4.4. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ưu . 46
Hình 4.5. Kết quả ly trích theo quy trình 4 . 46
Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 . 48
Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 . 48
Hình 4.8. Sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen
(Avicennia officinalis) 49
Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 2 trên cây mắm trắng . 50
Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng . 51
Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích . 52