Luận Văn Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây cóc trắng tại khu dự trữ sinh

MỤC LỤC


CHưƠNG TRANG


Trang tựa


Lời cảm ơn---------------------------------------------------------------------------------- iii


Tóm tắt -------------------------------------------------------------------------------------- iv


Summary------------------------------------------------------------------------------------- v


Mục lục-------------------------------------------------------------------------------------- vi


Danh sách các chữ viết tắt ---------------------------------------------------------------- ix


Danh sách các hình ------------------------------------------------------------------------- x


Danh sách các bảng------------------------------------------------------------------------ xi


1. MỞ ĐẦU --------------------------------------------------------------------------------- 1


1.1. Đặt vấn đề ---------------------------------------------------------------------------- 1


1.2. Mục đích------------------------------------------------------------------------------ 2


1.3. Yêu cầu ------------------------------------------------------------------------------- 2


1.4. Giới hạn đề tài ----------------------------------------------------------------------- 2


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU------------------------------------------------------------- 3


2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ---------------- 3


2.1.1. Chức năng khu dự trữ sinh quyển------------------------------------------- 3


2.1.2. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ -------------------------- 4


2.1.3. Cấu trúc Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ --------------- 8


2.2. Cây Cóc trắng----------------------------------------------------------------------- 10


2.2.1 Phân loại----------------------------------------------------------------------- 10


2.2.2 Đặc điểm hình thái cây Cóc trắng------------------------------------------ 11


2.3. Các phương pháp dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền------------ 12


2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA ở thực vật --------------------------------- 12


2.3.2. Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA -------------------------- 13


2.3.2.1. Phương pháp đo quang phổ ---------------------------------------------- 13


2.3.2.2. Phương pháp điện di ------------------------------------------------------ 14


2.3.3. PCR ---------------------------------------------------------------------------- 15


2.3.4. Các marker phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền --------------- 19


2.3.4.1. Microsatellite/ SSR ------------------------------------------------------- 19


2.3.4.2. AFLP ------------------------------------------------------------------------21


2.3.4.3. RAPD -----------------------------------------------------------------------25


3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện--------------------------------------------------28


3.1.1. Thời gian thực hiện ----------------------------------------------------------28


3.1.2. Địa điểm thực hiện -----------------------------------------------------------28


3.2. Vật liệu thí nghiệm-----------------------------------------------------------------28


3.2.1. Mẫu lá Cóc trắng -------------------------------------------------------------28


3.2.2. Hóa chất thí nghiệm ---------------------------------------------------------29


3.2.2.1. Hóa chất ly trích DNA----------------------------------------------------29


3.2.2.2. Hóa chất kiểm tra định lượng DNA ------------------------------------31


3.2.2.3. Hóa chất thực hiện phản ứng RAPD------------------------------------31


3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả ---------------------------32


3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm ----------------------------------------------------32


3.3. Phương pháp nghiên cứu ----------------------------------------------------------32


3.3.1. Phương pháp ly trích DNA -------------------------------------------------32


3.3.1.1. Quy trình 1 -----------------------------------------------------------------32


3.3.1.2. Quy trình 2 -----------------------------------------------------------------33


3.3.1.3. Quy trình 3 -----------------------------------------------------------------34


3.3.2. Kiểm tra kết quả ly trích DNA ---------------------------------------------35


3.3.2.1. Kiểm tra định lượng DNA bằng quang phổ kế------------------------35


3.3.2.2. Kiểm tra định tính DNA bằng điện di trên gel ------------------------35


3.3.3. Phản ứng RAPD --------------------------------------------------------------36


3.3.3.1. Primer -----------------------------------------------------------------------36


3.3.3.2. Bố trí thí nghiệm ----------------------------------------------------------36


4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN-------------------------------------------------------41


4.1. Kết quả thu thập mẫu lá Cóc trắng tại Khu dự trữ sinh quyển


rừng ngập mặn Cần Giờ ------------------------------------------------------------------41


4.2. Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA -------------------------42


4.2.1. Bảo quản mẫu-----------------------------------------------------------------42


4.2.2. Hoàn thiện quy trình ly trích------------------------------------------------43


4.3. Thực hiện phản ứng RAPD-----------------------------------------------------50


4.3.1. Thí nghiệm 1------------------------------------------------------------------50


4.3.2. Thí nghiệm 2------------------------------------------------------------------51


4.3.3. Thí nghiệm 3------------------------------------------------------------------54


4.3.4. Thí nghiệm 4------------------------------------------------------------------55


5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ----------------------------------------------------------59


5.1. Kết luận------------------------------------------------------------------------------59


5.2. Đề nghị ------------------------------------------------------------------------------60


TÀI LIỆU THAM KHẢO ----------------------------------------------------------------61


PHỤ LỤC-----------------------------------------------------------------------------------63


DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG


Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ------------------ 5


Hình 2.2 Cây Cóc trắng ------------------------------------------------------------------ 10


Hình 2.3 Lá Cóc trắng -------------------------------------------------------------------- 11


Hình 2.4. Hoa Cóc trắng ----------------------------------------------------------------- 12


Hình 2.5. Trái Cóc trắng ----------------------------------------------------------------- 12


Hình 2.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR --------------------------------------- 17


Hình 2.7. Cơ chế cắt của hai enzyme---------------------------------------------------22


Hình 2.8. Cơ chế gắn của 2 adapter MseI và EcoRI----------------------------------22


Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc --------------------------------------------23


Hình 4.1. Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ -----------------------------------------41


Hình 4.2. Mẫu lá Cóc trắng sau 30 ngày bảo quản -----------------------------------42


Hình 4.3. Quy trình 3 (quy trình ly trích nghiền trong N2 lỏng) --------------------45


Hình 4.4. Gel điện di kết quả ly trích DNA theo quy trình 2 và 3------------------46


Hình 4.5. Lá Cóc trắng bị đốm nâu và sâu ăn -----------------------------------------47


Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA từ mẫu lá tươi ban đầu


theo quy trình 2 và mẫu lá bảo quản sau 30 ngày theo quy trình 3 -----------------48


Hình 4.7. Hình điện di sản phẩm PCR ở thí nghiệm 1 -------------------------------50


Hình 4.8. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer 1 -------------------------------52


Hình 4.9. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer 2 và 9 -------------------------52


Hình 4.10. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 --------------------53


Hình 4.11. Hình điện di sản phẩm RAPD với primer RAH8, OPA5, OPA10 ----53


Hình 4.12. Hình điện di sản phẩm RAPD của thí nghiệm 3-------------------------54


Hình 4.13. Hình điện di sản phẩm RAPD của thí nghiệm 4-------------------------55


Hình 4.14. Cây phân loại một số cây Cóc trắng tại Khu dự trữ sinh quyển


rừng ngập mặn Cần Giờ ------------------------------------------------------------------57


DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG


Bảng 2.1. Nồng độ gel và kích thước đoạn cần phân tách --------------------------- 15


Bảng 3.1. Thành phần hóa chất phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 ---------------37


Bảng 3.2. Chu trình nhiệt 1 cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1----------------37


Bảng 3.3. Chu trình nhiệt 2 cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1----------------37


Bảng 3.4. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 ---------38


Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 ------------------38


Bảng 3.6. Thành phần hóa chất trong thí nghiệm 3-----------------------------------39


Bảng 3.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 ------------------40