Thạc Sĩ Biểu hiện và tiết Enzym Nattokinase tái tổ hợp ở Bacillus subtilis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NĂM - 2012

MỤC LỤC ( Luận văn dài 62 trang chỉ 1 file duy nhất)


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT . i
DANH MỤC CÁC BẢNG . iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
MỞ ĐẦU 1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. BỆNH NGHẼN MẠCH DO HUYẾT KHỐI . 3
1.1.1. Khái niệm về huyết khối . 3
1.1.2. Tình hình nghẽn mạch do huyết khối 3
1.1.3. Cơ chế hình thành huyết khối . 4
1.1.4. Sự phân hủy huyết khối bởi enzym nội sinh plasmin 8
1.1.5. Các nhân tố trong điều trị bệnh nghẽn mạch do huyết khối . 9
1.2. NATTOKINASE . 12
1.2.1. Nguồn gốc, đặc tính của Nattokinase 12
1.2.2. Cơ chế phân hủy fibrin của Nattokinase 14
1.2.3. Sinh tổng hợp và sản xuất Nattokinase . 15
1.2.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase tái tổ hợp trong và ngoài nước 17
1.3. CÁC HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG
TẾ BÀO VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS . 19
1.3.1. Biểu hiện gen trong tế bào vật chủ E. coli và Bacillus subtilis 19
1.3.2. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector sát nhập 20
1.3.3. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector plasmid có khả năng tự sao chép 25
1.4. HỆ THỐNG TIẾT CỦA BACILLUS SUBTILIS . 27



CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


2.1. VẬT LIỆU . 29
2.1.1. Dụng cụ 29
2.1.2. Thiết bị . 29
2.1.3. Hóa chất . 30
2.1.4. Môi trường . 33
2.1.5. Vật liệu sinh học . 34
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 37
2.2.1. Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto . 37
2.2.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người 38
2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis 38
2.2.4. Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR . 39
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE . 40
2.2.6. Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm 40
2.2.7. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+)
2.2.8. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong hệ thống vector pAX01
2.2.9. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein attokinase trong hệ thống vector pBG01
2.2.10. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp E. coli DH5
2.2.11. Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49
2.2.12. Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B. subtilis Luận văn Thạc sĩ Sinh học
2.2.13. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa gen aprE
2.2.14. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa gen aprE
2.2.15. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 53
2.2.16. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 54
2.2.17. Phân tích protein biểu hiện bằng SDS-PAGE 54
2.2.18. Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase . 55


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN PHẨM NATTO
3.2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG GEN MÃ HÓA SUBTILISIN VÀ CHỌN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN
3.2.1. Tách chiết DNA bộ gen Bacillus sp. phân lập từ Natto 59
3.2.2. Thu nhận gen mã hóa Nattokinase 60
3.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli mang gen aprE 61
3.2.3.1. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE 61
3.2.3.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE bằng phương pháp PCR
3.2.3.3. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE
bằng phương pháp cắt bằng enzym cắt hạn chế 63
3.2.3.4. Giải trình tự gen aprE, nhận định và tuyển chọn gen mã hóa thích hợp cho Nattokinase


3.3. DÒNG HÓA GEN aprE VÀO CÁC VECTOR ĐƯỢC CẤU TRÚC CHO BIỂU HIỆN Ở BACILLUS
3.3.1. Hệ thống biểu hiện pAX01 . 68
3.3.2. Hệ thống biểu hiện pBG01 72
3.4. TẠO CÁC DÒNG BACILLUS SUBTILIS MANG CASSET BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP
3.4.1. Sát nhập casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pxyl vào bộ gen các
chủng Bacillus subtilis . 75
3.4.2. Dòng hóa casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pgrac vào bộ gen các
chủng Bacillus subtilis DB104 . 78
3.5. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP NATTOKINASE
3.5.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pxyl 80
3.5.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE trong hệ thống pBG01 83
3.6. KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP . 85
3.6.1. Kiểm tra hoạt tính sơ bộ 85
3.6.2. Xác định hoạt độ phân hủy fibrin 86


CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN . 88
4.2. ĐỀ NGHỊ . 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 89
PHỤ LỤC . 93




DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu . 6
Bảng 2.1. Thành phần môi trường HS 33
Bảng 2.2. Thành phần môi trường LS 34
Bảng 2.3. Các trình tự mồi được sử dụng trong luận văn 36
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR . 39
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt plasmid pB bằng EcoRV . 42
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối pB và aprE . 43
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt kiểm tra pB-aprE bằng BamHI . 43
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng BamHI 45
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng SacII 45
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng nối 45
Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBG01 và gen aprE bằng BamHI và XbaI
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng nối 47
Bảng 3.1. So sánh hoạt độ phân hủy fibrin của dịch ngoại bào ở các chủng Bacillus




DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình 1.1. Cơ chê hình thành huyết khối . 5
Hình 1.2. Sự hoạt hóa và tác động lẫn nhau của các yếu tố đông máu 7
Hình 1.3. Cơ chế phân hủy fibrin in-vivo 9
Hình 1.4. Sản phẩm Natto 13
Hình 1.5. Cơ chế phân giải fibrin in-vivo bởi Nattokinase . 14
Hình 1.6. Sơ đồ vector sát nhập chứa promoter xylA được sử dụng trong luận văn 23
Hình 1.7. Sự sát nhập pAX01 vào DNA Bacillus subtilis nhờ trao đổi đồng dạng tại locus lacA .
Hình 1.8. Sơ đồ vector biểu hiện pBG01 được sử dụng trong luận văn 26
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) 35
Hình 2.2. Thang chuẩn DNA 1kb và protein 37
Hình 2.3. Chương trình PCR thu nhận gen aprE 40
Hình 3.1. Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ 57
Hình 3.2. Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto . . 58
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người ở các chủng phân lập sau 6 giờ ủ
Hình 3.4. DNA bộ gen chủng Bacillus sp. phân lập từ sản phẩm Natto và sản phẩm
khuếch đại gen aprE trên gel agarose 1% . 60
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang pB-aprE bằng phản ứng
PCR . 62
Hình 3.6. Kết quả sàng lọc 12 dòng tế bào E. coli DH5 có mang pB-aprE tương ứng bằng phản ứng PCR, bản mẫu là các plasmid .
Hình 3.7. Kết quả đại diện chọn dòng tế bào E. coli DH5 có mang pB- aprE bằng enzym cắt hạn chế BamHI
Hình 3.8. Trình tự peptide trưởng thành gồm 275 amino acid ở Nattokinase . 65
Hình 3.9. So sánh một phần trình tự nucleotide gen aprE của chủng phân lập với trình tự chuẩn .
Hình 3.10. Trình tự codon mã hóa gen aprE khuyết cytosine tại vị trí 437 66
Hình 3.11a. Trình tự gen aprE của chủng B2 cho thấy có sự khác biệt 9 nucleotide so với aprE công bố
Hình 3.11b. Một phần trình tự mã hóa gen aprE của chủng B2 được so sánh với
Nattokinase cho thấy khác biệt ở vị trí quan trọng Valin 298 (tương ứng vị trí 193 ở
peptide trưởng thành) . 68
Hình 3.12. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 1012, DB104
Hình 3.13. Kết quả dòng hóa ở E. coli DH5 70
Hình 3.14. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi pAX01-F/aprE-R.
Hình 3.15. Plasmid tái tổ hợp cắt với EcoRV. 71
Hình 3.16. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 .
Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprEF/
pMTL-R. 73
Hình 3.18. Plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE cắt với HindIII 74
Hình 3.19. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis 1012 khả nạp trên 2 đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh .
Hình 3.20. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi pAX01-F/aprE-R
Hình 3.21. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR với bản mẫu là bộ gen, mồi pAX01-F/aprE-R.
Hình 3.22. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis DB104 khả nạp trên đĩa môi trường
có bổ sung kháng sinh chloramphenicol. 79
Hình 3.23. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprEF/pMTL-R
Hình 3.24. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR với bản mẫu là các plasmid tái tổ hợp, cặp mồi aprE-F/pMTL-R
Hình 3.25. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 5 ml dịch môi trường sau nuôicấy
Hình 3.26. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi cấy
chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl . 82
Hình 3.27. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy
chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi PSgrac 84
Hình 3.28. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở trường
hợp kiểm soát bởi PSgrac . 85
Hình 3.29. Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại bào ở chủng B. subtilis
DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG sau 2 giờ ủ 86


MỞ ĐẦU
Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não) đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam, Philippin . do xu hướng “âu hóa” trong các chế độ ăn uống. Nếu huyết tụ ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ. Nếu huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 17 triệu người chết vì bệnh tim mạch và dự báo rằng bệnh do nghẽn mạch (hay huyết khối xơ vữa) sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào các năm tới đây. Huyết khối xơ vữa đã thật sự trở thành mối đe dọa đối với sức khỏe con người. Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất được phổ biến và thu hút nhiều sự chú ý. Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn mạch máu vì Natto chứa enzym phân hủy huyết khối “Nattokinase”, một nhân tố mang đến sự trường thọ cho người Nhật. Nattokinase (còn gọi là Subtilisin natto) là một serine protease được chiết tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Enzym này có khả năng làm tan đặc hiệu fibrin là một protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối. Hơn nữa, Nattokinase còn hỗ trợ tăng cường sản sinh ra Plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm tan huyết khối bám chặt nội mạc). Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết tụ thông thường khác như Urokinase, Streptokinase, và tissue Plasminogen Activator (t-PA).


Tuy nhiên, Urokinase và Streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả khi dùng đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân đột quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí. t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin mạnh nhưng t-PA có giá thành khá cao và thời gian bán phân hủy ngắn trong cơ thể. Nattokinase có hoạt tính phân hủy huyết tụ cao gấp 4 lần Plasmin, thực nghiệm cho thấy Nattokinase phân cắt plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu quả cấu trúc huyết khối trong cơ thể. Nattokinase đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị lâm sàng và không gây phản ứng phụ.



Từ trước đến nay, Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán rắn chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể. Thực tế, Nattokinase được ly trích từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao và hoạt tính ít ổn định. Vì thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp Nattokinase trong tự nhiên ở Bacillus subtilis natto khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn. Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thường chỉ hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa. Tuy nhiên, các công nghệ này thường ít được công bố.


Theo thống kê, nhu cầu sản phẩm Nattokinase ngày càng tăng cao ở thị trường Nhật Bản và Đài Loan. Ở các nước đang phát triển như Trung Quốc và Việt Nam, người dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng. Trong nước, các công ty dược phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản
phẩm từ Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản với giá thành cao. Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là định hướng của nhiều công ty trong nước. Do vậy, việc tìm hiểu và thu nhận nguồn gen mã hóa
Nattokinase tốt từ các chủng Bacillus natto và xây dựng hệ thống tái tổ hợp là tiếp cận mở ra triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức năng.
Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau:
+ Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản phẩm Natto có nguồn gốc từ Nhật Bản
+Thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR
+ Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống vector khác nhau ở Escherichia coli
+ Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104.
+ Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp.