Thạc Sĩ Biểu hiện và tiết enzym nattokinase tái tổ hợp ở bacillus subtilis

MỞ ĐẦU

Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não) đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam, Philippin . do xu hướng “âu hóa” trong các chế độ ăn uống. Nếu huyết tụ ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ. Nếu huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 17 triệu người chết vì bệnh tim mạch và dự báo rằng bệnh do nghẽn mạch (hay huyết khối xơ vữa) sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào các năm tới đây. Huyết khối xơ vữa đã thật sự trở thành mối đe dọa đối với sức khỏe con người. Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất được phổ biến và thu hút nhiều sự chú ý. Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn mạch máu vì Natto chứa enzym phân hủy huyết khối “Nattokinase”, một nhân tố mang đến sự trường thọ cho người Nhật. Nattokinase (còn gọi là Subtilisin natto) là một serine protease được chiết tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Enzym này có khả năng làm tan đặc hiệu fibrin là một protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối. Hơn nữa, Nattokinase còn hỗ trợ tăng cường sản sinh ra Plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm tan huyết khối bám chặt nội mạc). Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết tụ thông thường khác như Urokinase, Streptokinase, và tissue Plasminogen Activator (t-PA). Tuy nhiên, Urokinase và Streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả khi dùng đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân đột quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí. t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin mạnh nhưng t-PA có giá thành khá cao và thời gian bán phân hủy ngắn trong cơ thể. Nattokinase có hoạt tính phân hủy huyết tụ cao gấp 4 lần Plasmin, thực nghiệm cho thấy Nattokinase phân cắt plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu quả cấu trúc huyết khối trong cơ thể. Nattokinase đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị lâm sàng và không gây phản ứng phụ. Từ trước đến nay, Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán rắn chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể. Thực tế, Nattokinase được ly trích từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao và hoạt tính ít ổn định. Vì thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp Nattokinase trong tự nhiên ở Bacillus subtilis natto khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn. Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thường chỉ hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa. Tuy nhiên, các công nghệ này thường ít được công bố.
Theo thống kê, nhu cầu sản phẩm Nattokinase ngày càng tăng cao ở thị trường Nhật Bản và Đài Loan. Ở các nước đang phát triển như Trung Quốc và Việt Nam, người dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng. Trong nước, các công ty dược phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản phẩm từ Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản với giá thành cao. Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là định hướng của nhiều công ty trong nước. Do vậy, việc tìm hiểu và thu nhận nguồn gen mã hóa Nattokinase tốt từ các chủng Bacillus natto và xây dựng hệ thống tái tổ hợp là tiếp cận mở ra triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức năng.
Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau:
 Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản phẩm Natto có nguồn gốc từ Nhật Bản
 Thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR
 Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống vector khác nhau ở Escherichia coli
 Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104.
 Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp.