Thạc Sĩ Biểu hiện protein Hemagglutinin của virus cúm A/H5N1 trên hệ thống Baculovirus/tế bào côn trùng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Tp. Hồ Chí Minh-Năm 2011


MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Lời cám ơn

Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt . iv
Danh mục bảng và hình . vi

LỜI MỞ ĐẦU . 1
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1 3
1.1.1. Tình hình thế giới 3
1.1.2. Tình hình trong nước . 5
1.2. Đại cương về virus cúm A/H5N1 . 6
1.2.1. Phân loại 6
1.2.2. Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A/H5N1 7
1.2.3. Bộ gen của virus cúm A/H5N1 . 7
1.2.4. Kháng nguyên hemagglutinin . 9
1.2.5. Chu trình sinh sản của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ 13
1.2.5.1. Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ của virus ở tế bào chủ . 13
1.2.5.2. Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus . 13
1.2.5.3. Quá trình đóng gói và nẩy chồi 14
1.3. Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng . 15

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu 19
2.1.1. Hóa chất 19
2.1.2. Bộ tách chiết sử dụng 20
2.1.3. Các plasmid . 20
2.1.4. Tế bào 20

2.1.5. Thiết bị 20
2.1.6. Các vật liệu khác . 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu 21
2.2.1. Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp chứa gen H5 21
2.2.1.1. Thu nhận sản phẩm khuếch đại chứa gen H5 . 21
2.2.1.2. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại 22
2.2.1.3. Định lượng sản phẩm khuếch đại . 22
2.2.1.4. Chuyển gen H5 vào plasmid pFastBac1 . 22
2.2.1.5. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 . 23
2.2.1.6. Tách chiết plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 . 23
2.2.1.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 24
2.2.2. Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 . 25
2.2.2.1. Tạo dòng bacmid-H5 tái tổ hợp 25
2.2.2.2. Tách chiết bacmid-H5 tái tổ hợp 25
2.2.2.3. Kiểm tra bacmid-H5 tái tổ hợp . 26
2.2.3. Biểu hiện protein hemagglutinin . 26
2.2.3.1. Chuyển nhiễm bacmid-H5 tái tổ hợp
vào tế bào côn trùng Sf9 . 26
2.2.3.2. Thu nhận và bảo quản baculovirus tái tổ hợp 27
2.2.3.3. Nhân bản baculovirus tái tổ hợp . 27
2.2.3.4. Biểu hiện protein hemagglutinin . 28
2.2.3.5. Thu nhận protein hemagglutinin . 28
2.2.3.6. Phản ứng ngưng kết hồng cầu 28
2.2.3.7. Điện di SDS-PAGE . 30

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp mang gen H5 32
3.1.1. Thu nhận sản phẩm khuếch đại mang gen H5 32
3.1.2. Tạo dòng plasmid pFastBac1 tái tổ hợp 33
3.1.3. Kiểm tra plasmid pFastBac1 tái tổ hợp . 35
3.2. Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 38
3.3. Kiểm tra bacmid tái tổ hợp . 40
3.4. Biểu hiện protein hemagglutinin 41
3.4.1. Biểu hiện baculovirus tái tổ hợp mang gen H5 . 41
3.4.2. Nhân bản baculovirus tái tổ hợp . 44
3.4.3. Biểu hiện protein hemagglutinin . 46
3.4.4. Xác định và kiểm tra hoạt tính của protein hemagglutinin . 48
3.4.5. Xác định vị trí của protein hemagglutinin 50

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận . 53
4.2. Đề nghị . 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 54
PHỤ LỤC 62



DANH MỤC BẢNG


Bảng 1.1. Các phân đoạn bộ gen của virus cúm A và protein được mã hóa . 8
Bảng 3.1. Hình thái tế bào côn trùng bị baculovirus xâm nhiễm 47



DANH MỤC HÌNH


Hình 1.1. Số trường hợp nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 trên thế giới . 5
Hình 1.2. Số trường hợp nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 tại Việt Nam 6
Hình 1.3. Cấu trúc hạt virus cúm A . 7
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc sơ cấp của protein hemagglutinin 10
Hình 1.5. Sơ đồ protein hemagglutinin (H5) dạng trimer và monomer . 12
Hình 1.6. Chu trình sao chép của virus cúm A 14
Hình 1.7. Sơ đồ tạo baculovirus tái tổ hợp dùng BacPAK6 16
Hình 1.8. Sơ đồ mô tả hệ thống Bac-to-Bac® Baculovirus Expression 18
Hình 2.1. Nguyên tắc phản ứng ngưng kết hồng cầu . 29
Hình 2.2. Hình minh họa phương pháp điện di SDS-PAGE . 31
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại
từ plasmid tái tổ hợp pHW2000-7BTV(H5) 32
Hình 3.2. Sơ đồ plasmid tái tổi hợp pFastBac1-7BTV(H5) 33
Hình 3.3. Các khuẩn lạc E.coli TOP10 trên môi trường sàng lọc 34
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ plasmid thu nhận 35
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự plasmid thu nhận . 37
Hình 3.6. Khuẩn lạc E.coli DH10Bac trên môi trường sàng lọc . 49
Hình 3.7. Sơ đồ chuyển vị pFastBac1 tái tổ hợp vào bacmid 40
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ bacmid thu nhận 41
Hình 3.9. Tế bào Sf9 được chuyển nhiễm 43
Hinh 3.10. TS bao Sf9 trnac va 96 gia sau khi bi baculovirus xam nhiSm . 45
Hinh 3.11. Phan ung ngung kSt h6ng cu 59
Hinh 3.12. KSt qua din di SDS-PAGE tS bao Sf9 51

LỜI MỞ ĐẦU


Virus cúm gia cầm H5N1 gây bệnh, làm từ vong ở người và động vật đang là mối quan tâm, lo ngại của thế giới. Năm 1997, tại Hồng Kông, virus cúm gia cầm H5N1 lần đầu tiên lây truyền sang người làm tử vong 6 người trên 18 trường hợp dương tính [2], [26]. Cuối năm 2003, virus cúm H5N1 phát triển thành đại dịch trên gia cầm ở các nước Đông Nam Á, sau đó lan sang các quốc gia ở châu Âu và châu Phi. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến ngày 22/06/2011, tổng số người tử vong trên thế giới là 329 trên 562 trường hợp dương tính với virus cúm H5N1. Riêng tại Việt Nam, số ca tử vong là 59 trên 119 trường hợp dương tính H5N1, đứng thứ hai thế giới sau Indonesia [46]. Do đó, việc nghiên cứu, phòng ngừa và ngăn chặn virus H5N1 là công việc hết sức cấp thiết.

Trong số 11 hoặc 12 protein của virus cúm A/H5N1 [7], [45], hemagglutinin là một trong hai protein bề mặt quan trọng nhất mang yếu tố quyết định kháng nguyên. Đến nay, nhiều công trình nghiên cứu biểu hiện protein hemagglutinin trên các hệ thống khác nhau đã được công bố như: hệ thống E.coli [11], nấm men [43], thực vật[39], côn trùng [26] và động vật [19].

Trong đề tài này, chúng tôi biểu hiện protein hemagglutinin của chủng virus cúm A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008(H5N1) trên hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng Sf9 bởi chúng có ưu điểm biểu hiện nhanh chóng một protein có hoạt tính sinh học. Protein hemagglutinin này được ứng dụng cho những nghiên cứu sâu hơn như: tạo kháng thế đơn dòng, tạo Kit chẩn đoán hay phát triển vaccine.


Mục tiêu của đề tài:

- Khuếch đại đoạn DNA mang gen H5 của chủng virus cúm A/DK/VietNam/7B-TV/2008 (H5N1) từ plasmid tái tổ hợp pHW2000- H5(7BTV).
- Chèn đoạn DNA mang gen H5 vào plasmid pFastBac1.
- Chuyển gen H5 cùng promoter polyhedrin hoạt tính mạnh vào bacmid nhằm tạo bacmid-H5 tái tổ hợp.
- Chuyển nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng Sf9 nhằm tạo baculovirus tái tổ hợp mang gen H5.
- Nhân bản baculovirus tái tổ hợp.
- Biểu hiện protein hemagglutinin trên tế bào côn trùng Sf9.
- Kiểm tra hoạt tính sinh học của protein hemagglutinin.
- Xác định vị trí của protein hemagglutinin trong tế bào côn trùng Sf9.

Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận văn: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch,Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện: đề tài được thực hiện từ tháng 7/2010 – 11/2011.