Tài liệu Bài giảng công nghệ sinh học ứng dụng

MỤC LỤC

Bài 1 CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP .5
I. Khái niệm 5
1. Ý nghĩa của tạo dòng DNA 5
2. Tạo dòng DNA là gì? .5
3. Tại sao sự tạo dòng DNA quan trọng như vậy? Ý nghĩa của tạo dòng đối với nghiên cứu
và công nghệ sinh học .5
II. Các enzyme tác động lên DNA 11
1.Nuclease .12
2. Ligase .13
3. Polymerase 13
4. Các enzyme biến đổi DNA .16
5. Topoisomerase .17
III. Enzym hạn chế: Restriction endonuclease .17
1. Phát hiện và kiểu tác động của enzyme hạn chế 18
2. Enzyme hạn chế loại II cắt DNA ở những trình tự hoàn toàn xác định .19
3. Đầu bằng và đầu dính .21
4. Số vị trí nhận biết của enzyme hạn chế trong phân tử DNA .22
5. Quá trình cắt bằng enzyme hạn chế trong phòng thí nghiệm .23
6. Phân tích kết quả của phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế 24
6.1. Sự tách các phân tử bằng điện di 24
6.2. Sự hiển thị của phân tử DNA trong gel 26
6.3. Đánh giá độ lớn của các đoạn DNA .28
6.4. Lập bản đồ giới hạn phân tử DNA .29
IV. Gắn các phân tử DNA (ligation) 31
1. Tác dụng của DNA-ligase .31
2. Các đầu dính tăng hiệu quả phản ứng gắn 31
3. Tạo đầu dính từ phân tử DNA đầu bằng .32
V. Vector tạo dòng .39
1. Vector plasmid .39
1.1. Vector tạo dòng pB322 .42
1.2. pUC8: Plasmid có gene chọn lọc LacZ 44
1.3. pGEM3Z: Sự phiên mã DNA tạo dòng in vitro 45
2. Vector tạo dòng trên cơ sở thực khuẩn thể M13 46
2.1. Phát triển vector tạo dòng M13mp2 .46
2.2. M13mp7 - Những vị trí tạo dòng đối xứng .47
3. Vector tạo dòng là phage 49
3.1. Vector thay thế và vector xen đoạn .53
3.2.Thí nghiệm tạo dòng với vector xen đoạn hoặc thay thế .55
4. Các vector lai plasmid/phage .56
4.1. Cosmid .56
4.2. Phagemid . .58
VI. Tạo dòng gene . .58
1. Tạo dòng gene đã biết 58
2. Tạo dòng gene chưa biết .68

Bài 2 CÁC KỸ THUẬT CHÍNH SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH NUCLEIC ACID 71
I. Phương pháp tách chiết DNA . .71
1. Phương pháp tách DNA tổng số 71
2. Tách chiết DNA plasmid .78
3. Tinh sạch DNA của phage .84
II. Kỹ thuật lai nucleic acid .90
1. Kỹ thuật Southern blot 90
2. Kỹ thuật Northern blot 106
3. Kỹ thuật Western blot .106
III. Kỹ thuật xác định trình tự DNA .111
1. Phương pháp Sanger-Coulson (phương pháp enzyme hay dideoxy) 111
2. Phương pháp Maxam-Gilbert (Phương pháp hoá học) .113
3. Phân tích trình tự DNA dài 115
4. Các khả năng xác định trình tự DNA 117
5. Giải trình tự gene bằng phương pháp tự động 117
IV. Kỹ thuật PCR .120
1. Nguyên tắc .120
2. Kỹ thuật PCR 121
3. Phân tích sản phẩm PCR .126
4. Những khó khăn do sự khiếm khuyết của Taq-polymerase .129
5. Ứng dụng PCR .130
V. Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR 133
1. Kỹ thuật RAPD: Đa hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên. .133
2. Kỹ thuật AFLP (amplified fragment length polymorphism) – Sự đa hình chiều dài các
phân đoạn DNA được khuếch đại .134
3. Kỹ thuật SSR (simple sequence reppeats): Đa hình đoạn trình tự lặp lại đơn giản 135
VI. Thư viện hệ gene (geneomic library) và thư viện cDNA 136
1. Thư viện hệ gene ( geneomic library) . .136
2. Thư viện cDNA 139

Bài 3 CÔNG NGHỆ CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT 145
I. Giới thiệu chung .145
II. Phương pháp chuyển gene gián tiếp 146
1. Hệ thống Agrobacterium 146
2. Ti-plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật .148
3. T-DNA và các trật tự biên 25 bp . .149
4. Vùng vir 149
5. Quá trình chuyển T-DNA . 150
6. Các dẫn xuất Ti-plasmid như là vector thực vật . .151
7. Phương thức truyền gene vào thực vật nhờ Agrobacterium . .153
III. Phương pháp chuyển gene trực tiếp 156
1. Chuyển gene vào protoplast .156
2. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện .157
3. Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene 157
4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection) .160

Bài 4 ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT
1. Chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ .160
2. Chuyển gene kháng sâu bệnh . 161
3. Chuyển gene gây chín chậm- DR (delayed ripening ) 162
4. Chuyển gene tạo hoa có màu sắc và kiểu hoa mới . 164
5. Chuyển gene sản xuất protein động vật và người 167
6. Chuyển gene thay đổi protein .168
7. Chuyển gene tạo tính bất dục của cây trồng .169
8. Chuyển gene giúp cây trồng chống điều kiện bất lợi .171

Bai 5 CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 176
I. Giới thiệu chung . 176
1. Sơ lược lịch sử phát triển 176
2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật .177
3. Một số thuật ngữ và khái niệm cơ bản . 177
4. Môi trường dinh dưỡng 179
5. pH của môi trường .182
6. Vô trùng mẫu cấy .182
II. Thụ phấn và nuôi cấy phôi (hữu tính) in vitro 183
1. Tính bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh - thụ phấn in vitro .183
2. Tính bất hợp của giao tử sau khi thụ tinh - Nuôi cấy phôi in vitro .183
3. Kỹ thuật nuôi cấy phôi hữu tính .184
4. Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi hữu tính 184
III. Nhân giống in vitro 185
1. Ý nghĩa của việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 185
2. Các phương thức nhân giống in vitro .185
3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro .189
5. Nhân giống in vitro và các đặc điểm không di truyền .192
IV. Nuôi cấy bao phấn và tạo giống cây trồng 192
1. Vấn đề đơn bội ở thực vật .192
2. Phương pháp tạo cây đơn bội in vitro .193
3. Ứng dụng của đơn bội .195
4. Một số tồn tại trong nuôi cấy đơn bội .196
V. Nuôi cấy tế bào trần & triển vọng ứng dụng .196
1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần 197
2. Dung hợp tế bào trần .198
3. Ứng dụng của protoplast 199
VI. Làm sạch bệnh virus trong công tác phục tráng giống cây trồng 200
1. Nguyên lý làm sạch virus và duy trì tính sạch bệnh .200
2. Các kỹ thuật làm sạch virus in vitro .201
3. Kiểm tra, nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh 202
VII. Tạo đột biến và chọn dòng tế bào thực vật 204
1. Khái niệm .204
2. Các nguyên nhân chính gây biến dị soma 204
3. Cách chọn dòng .206
4. Các hướng chính trong chọn lọc biến dị soma .206
5. Xác định các biến dị trong nuôi cấy mô .208
6. Khả năng ứng dụng của chọn lọc biến dị soma 208
VIII. Công nghệ tế bào trong bảo quản nguồn gene 209
1. Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu .209
2. Phương pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời .210

LỜI NÓI ĐẦU

Công nghệ sinh học hiện đại được ra đời và phát triển như vũ bão, mang lại những thành tựu tuyệt vời cho nhân loại. Hiện nay, công nghệ sinh học không chỉ là công cụ nghiên cứu sắc bén cho phép nghiên cứu cơ chế của các hiện tượng sống ở mức độ phân tử mà còn nhanh c hóng trở thành một công nghệ sản xuất với những sản phẩm hoàn to àn mới mẽ trên mọi lĩnh vực, trước hết là y tế và nông nghiệp. Để đáp ứng cho nhu cầu học tập của sinh viên khoa Nông học, tập thể tác giả chúng tôi được giao nhiệm vụ biên soạn giáo trình “Công nghệ sinh học thực vật”. Nội dung giáo trình gồm 4 chương, với sự phân công biên soạn như sau:

Chương 1: Công nghệ DNA tái tổ hợp
Chương 2: Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích acid nucleic
Chương 3: Công nghệ chuyển gen vào tế bào thực vật
Chương 4: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
Do mới được xuất bản lần đầu nên giáo trình khó tránh khỏi thiếu sót hoặc chưa đáp ứng được yêu cầu bạn đọc. Vì thế, chúng tôi mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất bản sau được hoàn thiện hơn.