Chuyên Đề ADN tái tổ hợp

Mục lục
I. Khái niệm chung
II. Mục đích
III. Vật liệu tách dòng gen
IV. Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
- DGGE ADN/ARN Sai khác một vài nucleotit
V. Về vectơ / thể truyền
VI. Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp
VII. Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng hệ gen
VIII. Sàng lọc các dòng gen trong ngân hàng gen

I. Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) được dùng để chỉ các phân tử ADN được tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn AND xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau.
Trong thực tế, công nghệ ADN tái tổ hợp đôi khi được dùng đồng nghĩa với các thuật ngữ nhân dòng phân tử (molecular/DNA cloning), hay kỹ thuật di truyền (geneticengineering). Nhưng thực chất các thuật ngữ này có khác nhau
II. Mục đích
1. Phân lập các gen từ hỗn hợp nhiều gen trong tế bào, để có thể phân tích và nghiên cứu từng gen riêng lẻ.
2. Nhân một dòng gen đã được phân lập lên một số lượng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu số lượng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu nghiên cứu.
3. Khả năng tạo ra những gen/tổ hợp gen mới.
III. Vật liệu tách dòng gen
1. ADN
2. mARN (sử dụng kỹ thuật RT-PCR).
ADN tái tổ hợp thực hiện như thế nào?
Các bước cơ bản thực hiện ADn tái tổ hợp
1. Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm.
2. Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3’, 5’ phù hợp.
3. Chọn lọc véctơ (thể truyền) phù hợp.
4. Cải biến đầu 3’ và 5’của véctơ và phân tử ADN ngoại lai.
5. Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai.
6. Đưa véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên.
7. Sàng lọc để chọn các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp.
8. Xác định đặc tính các dòng, và sử dụng các dòng cho các mục đích nghiên cứu khác nhau
Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết ADN
- Các dung môi hữu cơ làm mất nước, thay đổi môi trường điện môi à kết tủa protein & ADN.
- Độ pH thường trung tính hoặc hơi kiềm (7,0 – 8,5).
- Phenol, chloroform, isoamylalcohol thường được dùng để kết tủa protein (vd. Chloroform/isoamylalcohol 24/1).
- Một số hợp chất chống oxy hóa như 2-mercapthoethanol, DTT (dithiothreito), 8-hydroxyquinoline làm giảm nguy cơ gây biến tính axit nucleic. SDS làm vỡ màng tế bào. EDTA loại các ion kim loại.
- CTAB loại bỏ các hợp chất polysaccharide/polyphenol ở thực vật. Lysozyme được dùng để phân giải lớp peptidoglycan ở vi khuẩn.
- Các dung môi alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) được dùng để kết tủa axit nucleic. Các muối (vd. acetate) trung hòa điện tích và làm giảm khả năng tan của axit nucleic. T[SUP]0[/SUP] -20[SUP]0[/SUP] C/0[SUP]0[/SUP]C (1/2h – 24h).

Tóm tắt về ADN Tái tổ hợp
ADN tái tổ hợp là các kỹ thuật nhằm tạo ra những phân tử ADN mới được “lắp ráp” từ các phân đoạn ADN có ngnồn gốc khác nhau. Cơ sở được “lắp ráp” từ các phân đoạn ADN có ngnồn gốc khác nhau. Cơ sở của công nghệ ADN tái tổ hợp là tính phổ biến của mã di truyền.
Công nghệ ADN tái tổ hợp phát triển nhanh chóng nhờ sự phát hiện ra và hiểu biết ngày càng rõ hơn về các loại enzym có khả năng cải biến ADN, ARN, trong đó có các enzym giới hạn.
Việc tách dòng và xây dựng ngân hàng hệ gen của nhiều loài sinh vật khác nhau, trong đó có cả những loài có hệ gen lớn như người, thực hiện được là nhờ sự phát triển của nhiều loại véctơ khác nhau, như plasmid, phage, cosmid, véctơ con thoi, YAC, BAC, cho phép tách dòng các đoạn trình tự khác nhau có kích thước từ vài kb đến 500 kb.
Có hai loại ngân hàng gen: Ngân hàng hệ gen mang toàn bộ các trình tự có trong hệ gen của một cơ thể, và thư viện cADN mang các trình tự là sản phẩm phiên mã ngược từ các phân tử mARN có mặt trong một loại tếbào nhất định (phản ánh những gen được biểu hiện trong tế bào đó).
Ngân hàng hệ gen có ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu lập bản đồ di truyền, giải mã trình tự hệ gen. Thư viện cADN có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm hiểu sự biểu hiện và chức năng của các gen trong tế bào.